Kerteszia cruzii and extra-Amazonian malaria in Brazil: Challenges due to climate change in the Atlantic Forest.

Kerteszia cruzii is a sylvatic mosquito and the primary vector of Plasmodium spp., which can cause malaria in humans in areas outside the Amazon River basin in Brazil. Anthropic changes in the natural environments are the major drivers of massive deforestation and local climate change, with serious impacts on the dynamics of mosquito communities and on the risk of acquiring malaria. Considering the lack of information on the dynamics of malaria transmission in areas across the Atlantic Forest biome, where Ke. cruzii is the dominant vector, and the impact of climate drivers of malaria, the present study aimed to: (i) investigate the occurrence and survival rate of Ke. cruzii based on the distinct vegetation profiles found in areas across the coastal region of the Brazilian Atlantic Forest biome; (ii) estimate the extrinsic incubation period (EIP) and survival rates of P. vivax and P. falciparum parasites in Ke. cruzii under current and future scenarios. The potential distribution of Plasmodium spp. was estimated using simulation analyses under distinct scenarios of average temperature increases from 1 °C to 3.7 °C. Our results showed that two conditions are necessary to explain the occurrence and survival of Ke. cruzii: warm temperature and presence of the Atlantic Forest biome. Moreover, both Plasmodium species showed a tendency to decrease their EIP and increase their estimated survival rates in a scenario of higher temperature. Our findings support that the high-risk malaria areas may include the southern region of the distribution range of the Atlantic Forest biome in the coming years. Despite its limitations and assumptions, the present study provides robust evidence of areas with potential to be impacted by malaria incidence in a future scenario. These areas should be monitored in the next decades regarding the occurrence of the mosquito vector and the potential for malaria persistence and increased occurrence.

Escolar con malaria por plasmodium falciparum de África: riesgo para la salud pública en Honduras / School child with Plasmodium falciparum malaria from Africa: public health risk in Honduras

Antecedentes: Los viajes a zonas endémicas con parásitos resistentes, la respuesta evolutiva de Plasmodium y los sistemas sanitarios debilitados, comprometen el control mundial y local de la malaria. Descripción del Caso clínico: Niño, 6 años, atendido en Hospital Escuela Universitario (HE), Tegucigalpa, referido desde Siguatepeque, Comayagua, por dudas en diagnóstico de laboratorio y antecedente de vivir en África y cuatro episodios de malaria por P. falciparum (2015-2017). Al ingreso presentó cuadro entérico e informe de Plasmodium spp. Se inició tratamiento con cloroquina, omitida y substituida al día siguiente por derivado de artemisinina al confirmar P. falciparum y 0.7% de eritrocitos parasitados. Presentó buena respuesta clínica y parasitológica, egresando al 7mo día intrahospitalario después de 72 horas afebril. La gota gruesa al egreso informó estadios sexuales de P. falciparum, administrándose primaquina al estar disponible 7 días después. En control ambulatorio al 5to día post-egreso, no se observaron parásitos aunque persistían leucocitos con pigmento malárico fagocitado. Cuatro familiares convivientes en África fueron examinados. El padre, que informó cefalea leve y febrícula, fue detectado con estadios asexuales de P. falciparum; presentó buena respuesta al tratamiento con derivado de artemisinina. Conclusiones: La descripción del caso y los diferentes eslabones en su manejo clínico y epidemiológico, reflejan la potencialidad de complicación de la malaria. La introducción de parásitos resistentes a la cloroquina constituye una amenaza de salud pública, principalmente ante fallas evitables en el sistema sanitario. Es necesario fortalecer el diagnóstico temprano y tratamiento oportuno especialmente en el contexto de la eliminación de malaria en Mesoamérica...(AU)

Plasmodium falciparum GFP-E-NTPDase expression at the intraerythrocytic stages and its inhibition blocks the development of the human malaria parasite.

Plasmodium falciparum is the causative agent of the most dangerous form of malaria in humans. It has been reported that the P. falciparum genome encodes for a single ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase), an enzyme that hydrolyzes extracellular tri- and di-phosphate nucleotides. The E-NTPDases are known for participating in invasion and as a virulence factor in many pathogenic protozoa. Despite its presence in the parasite genome, currently, no information exists about the activity of this predicted protein. Here, we show for the first time that P. falciparum E-NTPDase is relevant for parasite lifecycle as inhibition of this enzyme impairs the development of P. falciparum within red blood cells (RBCs). ATPase activity could be detected in rings, trophozoites, and schizonts, as well as qRT-PCR, confirming that E-NTPDase is expressed throughout the intraerythrocytic cycle. In addition, transfection of a construct which expresses approximately the first 500 bp of an E-NTPDase-GFP chimera shows that E-NTPDase co-localizes with the endoplasmic reticulum (ER) in the early stages and with the digestive vacuole (DV) in the late stages of P. falciparum intraerythrocytic cycle.

Antimaláricos a partir de moléculas obtidas por síntese como análogos de cloroquina e compostos naftoquinoidais / Antimalarials from molecules obtained by synthesis as chloroquine analogues and compounds naftoquinoidais

A resistência de Plasmodium falciparum aos antimaláricos esquizonticidas sanguíneos disponíveis, como a atovaquona e derivados de artemisinina, e a de P. vivax à cloroquina (CQ), exige a busca por alternativas quimioterápicas, objetivo deste trabalho. Como estratégia geradora de novos protótipos antimaláricos, foram feitas modificações estruturais (i) na CQ, as quais resultaram em 10 análogos de cloroquina (AnCQ), sendo quatro complexados com platina (AnCQPt), com atividade previamente descrita na malária pelo P. berghei; (ii) na atovaquona, originando oito naftoquinonas; e (iii) no lapachol, resultando em 11 compostos naftoquinoidais. Essas classes de moléculas foram avaliadas in vitro quanto a sua citotoxicidade (MCL50) e atividade antiplasmodial (IC50) contra parasitos sensíveis(S) ou resistentes(R) à CQ. Os índices de seletividade (IS), expressos pela razão entre essas duas atividades biológicas, foram obtidos. Os AnCQ foram mais ativos contra P. falciparum CQ-R in vitro e mais ativos que os AnCQPt e mostraram IS superiores ao da CQ. Para elucidar seu modo de ação, os AnCQ foram avaliados in silico quanto à ancoragem molecular na lactato-desidrogenase de P. falciparum(PfLDH) ou humana (HssLDH)...

Antimaláricos a partir de moléculas obtidas por síntese como análogos de cloroquina e compostos naftoquinoidais

A resistência de Plasmodium falciparum aos antimaláricos esquizonticidas sanguíneos disponíveis, como a atovaquona e derivados de artemisinina, e a de P. vivax à cloroquina (CQ), exige a busca por alternativas quimioterápicas, objetivo deste trabalho. Como estratégia geradora de novos protótipos antimaláricos, foram feitas modificações estruturais (i) na CQ, as quais resultaram em 10 análogos de cloroquina (AnCQ), sendo quatro complexados com platina (AnCQPt), com atividade previamente descrita na malária pelo P. berghei; (ii) na atovaquona, originando oito naftoquinonas; e (iii) no lapachol, resultando em 11 compostos naftoquinoidais. Essas classes de moléculas foram avaliadas in vitro quanto a sua citotoxicidade (MCL50) e atividade antiplasmodial (IC50) contra parasitos sensíveis(S) ou resistentes(R) à CQ. Os índices de seletividade (IS), expressos pela razão entre essas duas atividades biológicas, foram obtidos. Os AnCQ foram mais ativos contra P. falciparum CQ-R in vitro e mais ativos que os AnCQPt e mostraram IS superiores ao da CQ. Para elucidar seu modo de ação, os AnCQ foram avaliados in silico quanto à ancoragem molecular na lactato-desidrogenase de P. falciparum(PfLDH) ou humana (HssLDH).

O AnCQ33 apresentou melhor conformação na PfLDH; AnCQ37 apresentou especificidade em relação à enzima humana. Os AnCQ com maiores IS (AnCQ 33 e 37) e a CQ foram ainda avaliados quanto sua capacidade de inibir a formação de Beta-hematina, sendo tão ou menos ativos que a CQ. Avaliados quanto ao potencial de causar a morte (atividade citocida) ou impedir o crescimento (atividade citostática) de P. falciparum CQ-Se CQ-R, esses análogos demonstraram potencial citocida similar, e potencial citostático maior contra parasitos CQ-R. Os AnCQ foram ativos contra parasitos CQ-S e CQ-R na malária pelo P. berghei. Duas naftoquinonas (2 e 5) apresentaram IS superiores ao da CQ e inibiram a parasitemia pelo P. bergheiem camundongos, com destaque para a naftoquinona 2. Em conclusão, os melhores candidatos à produção de um antimalárico esquizonticida sanguíneo foram AnCQ33 e 37 e a naftoquinona 2.

Avaliação da atividade antimalárica de novos derivados quinolínicos / Evaluation of the antimalarial activity of new quinoline derivatives

A malária é uma doença causada por cinco espécies de parasitos do gênero Plasmodium que causa anualmente a morte de milhares de pessoas, principalmente em países pobres da África. Muito antiga, uma diversidade de fármacos já foram empregados na tentativa de erradicação da doença, entretanto o aparecimento de cepas resistentes, bem como efeitos adversos gerados pelo tratamento impossibilitou tal ação. Os quinolínicos configuram uma grande parte destes tratamentos, apresentando uma notável atividade antimalárica. Neste trabalho nós avaliamos o potencial antimalárico de três novos derivados quinolínicos BS 260, BS 318 e BS 373 em culturas de Plasmodium falciparum, cepa w2, cloroquina resistente. BS 373 apresentou melhor atividade contra culturas de Plasmodium falciparum e, assim como o BS 318, foi capaz de inibir a biocristalização de hemozoína pelos parasitos. A microscopia eletrônica de transmissão revelou uma desorganização celular, diminuição do tamanho e quantidade de cristais de hemozoína no vacúolo digestivo, bem como vacuolizações citoplasmáticas e presença de estruturas membranares no vacúolo digestivo, o que indica a ocorrência de um processo autofágico nas células tratadas com 10 LM e 20 LM do BS 373. A presença de cristais citoplasmáticos indica a ocorrência de autólise pela ruptura da membrana do vacúolo digestivo. Por fim, o efeito dos tratamentos se mostrou irreversível nos parasitos com 24 horas de tratamento para BS 318 e BS 373, enquanto que para BS 260 essa irreversibilidade só foi observada após 48 horas. Nossos dados mostram que os derivados quinolínicos testados são efetivos contra culturas de P. falciparum, configurando bons candidatos à novas moléculas antimaláricas.

Malaria is a disease caused by five Plasmodium species that cause deaths of thousands of people annually, mostly in poor countries of Africa. Very anccient, a variety of drugs have been used in an attempt to eradicate the disease, however the emergence of resistant strains, as well as adverse effects caused by treatment prevented such action. The quinoline are a large part of these treatments, presenting a remarkable antimalarial activity. In this paper we evaluate the antimalarial potential of three new quinoline derivative BS 260, BS 318 and BS 373 in Plasmodium falciparum chloroquine resistant, w2 strain, cultures. BS 373 showed the best activity against Plasmodium falciparum cultures, while and analogously to BS 318 was able to inhibit the hemozoin formation by parasites. The transmission electron microscopy revealed a cell disorganization, decreased size and amount of hemozoin crystals in the digestive vacuole, cytoplasmic vacuolization and presence of membrane structures in the digestive vacuole, which indicates an autophagic process in cells treated with 10 LM and 20 LM BS 373. Cytoplasmic being crystals indicate parasite cell autolusis caused by digestive vacuole membrane disrupture. Finally, the effect of treatment proved irreversible on parasites at 24 hours of treatment for BS 318 and BS 373, whereas for BS 260 this irreversibility was only observed after 48 hours. Our data show that the quinoline derivatives tested are effective against P. falciparum cultures, setting good candidates for new antimalarial molecules.

Desenvolvimento de um protocolo de PCR em Tempo Real para diagnóstico de malária subpatente e infecções mistas por Plasmodium Vivax e Plasmodium falciparum / Development of a PCR protocol Real time to diagnosis of malaria and subpatent mixed infections with Plasmodium Vivax and Plasmodium falciparum

O diagnóstico adequado de malária permanece como um dos pilares dos programas de controle da doença no mundo, já que um diagnóstico eficiente permite a identificação precoce de casos e definição do esquema terapêutico, contribuindo para interrupção do ciclo biológico do parasito. A microscopia óptica (MO), atual diagnóstico de referência para malária, tem apresentado limitações, principalmente em casos de co-infecções e baixas parasitemias. Assim sendo, busca-se por técnicas mais sensíveis e específicas para auxiliar a MO, sendo os métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) considerados mais adequados para identificação de indivíduos com infecção submicroscópica. Entretanto, os vários protocolos de PCR apresentados até o momento tem se baseado no gene da subunidade menor do RNA ribossomal 18S dos plasmódios (18S rRNA), que se encontra em poucas cópias no genoma destes parasitos. Recentemente, foram descritas sequências não ribossomais para identificação de Plasmodium vivax(Pvr47) e Plasmodium falciparum (Pfr364), sendo estas sequências promissoras para o diagnóstico molecular de malária. Baseando-se nestes achados, este trabalho propôs o desenvolvimento de um protocolo de Real-Time PCR para validar os alvos Pvr47 e Pfr364 para o diagnóstico de malária vivax e falciparum,respectivamente, com ênfase em infecções mistas e baixas parasitemias. Após padronização com sucesso da técnica de Real-Time PCR (RT-LAMAL), a mesma foi comparada a três outros protocolos moleculares, sendo duas técnicas baseadas no gene 18S rRNA – Nested-PCR (Snounou et al., 1993) e Real-Time PCR (Mangold etal., 2005) – e uma PCR convencional baseada nos alvos Pvr47/Pfr364 (Demas etal., 2011)...

Para avaliar os protocolos quanto aos seus limites de detecção de infecções únicas e mistas por P. vivax e P. falciparum, foram realizadas titulações de misturas artificiais com diferentes concentrações dos parasitos. Os resultados obtidos nesta etapa revelaram que a PCR-Demas e RT-LAMAL apresentaram os menores limites de detecção para P. vivax e P. falciparum, tanto em infecções únicas quanto mistas, e que o protocolo de RT-Mangold foi incapaz de detectar coinfecções.Posteriormente, os protocolos foram avaliados para o diagnóstico de malária em amostras de campo, incluindo área não endêmica (n=117) e área endêmica para malária (n=163). Os resultados revelaram que os protocolos de RT-Mangold,PCR-Demas e RT-LAMAL foram mais eficientes na detecção de parasitemias submicroscópicas, porém, o protocolo de RT-Mangold novamente mostrou ser incapaz de detectar infecções mistas. Em conjunto, os dados obtidos demonstraram que os alvos Pvr47/Pfr364 foram mais adequados para o diagnóstico molecular de malária vivax e falciparum do que o gene 18S rRNA. Contudo, o protocolo aqui desenvolvido (RT-LAMAL) se mostra em vantagem à PCR-Demas,com maior rapidez na obtenção de resultados, dispensando a revelação em gel deagarose e uso de brometo de etídeo, além de diminuir a possibilidade de contaminação de reagentes e amostras. Portanto, conclui-se que a RT-LAMAL possui grande potencial para o diagnóstico molecular de certeza de pacientes com infecções mistas e baixas parasitemias...

Desenvolvimento de um protocolo de PCR em Tempo Real para diagnóstico de malária subpatente e infecções mistas por Plasmodium Vivax e Plasmodium falciparum

O diagnóstico adequado de malária permanece como um dos pilares dos programas de controle da doença no mundo, já que um diagnóstico eficiente permite a identificação precoce de casos e definição do esquema terapêutico, contribuindo para interrupção do ciclo biológico do parasito. A microscopia óptica (MO), atual diagnóstico de referência para malária, tem apresentado limitações, principalmente em casos de co-infecções e baixas parasitemias. Assim sendo, busca-se por técnicas mais sensíveis e específicas para auxiliar a MO, sendo os métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) considerados mais adequados para identificação de indivíduos com infecção submicroscópica. Entretanto, os vários protocolos de PCR apresentados até o momento tem se baseado no gene da subunidade menor do RNA ribossomal 18S dos plasmódios (18S rRNA), que se encontra em poucas cópias no genoma destes parasitos. Recentemente, foram descritas sequências não ribossomais para identificação de Plasmodium vivax(Pvr47) e Plasmodium falciparum (Pfr364), sendo estas sequências promissoras para o diagnóstico molecular de malária. Baseando-se nestes achados, este trabalho propôs o desenvolvimento de um protocolo de Real-Time PCR para validar os alvos Pvr47 e Pfr364 para o diagnóstico de malária vivax e falciparum,respectivamente, com ênfase em infecções mistas e baixas parasitemias. Após padronização com sucesso da técnica de Real-Time PCR (RT-LAMAL), a mesma foi comparada a três outros protocolos moleculares, sendo duas técnicas baseadas no gene 18S rRNA – Nested-PCR (Snounou et al., 1993) e Real-Time PCR (Mangold etal., 2005) – e uma PCR convencional baseada nos alvos Pvr47/Pfr364 (Demas etal., 2011).

Para avaliar os protocolos quanto aos seus limites de detecção de infecções únicas e mistas por P. vivax e P. falciparum, foram realizadas titulações de misturas artificiais com diferentes concentrações dos parasitos. Os resultados obtidos nesta etapa revelaram que a PCR-Demas e RT-LAMAL apresentaram os menores limites de detecção para P. vivax e P. falciparum, tanto em infecções únicas quanto mistas, e que o protocolo de RT-Mangold foi incapaz de detectar coinfecções.Posteriormente, os protocolos foram avaliados para o diagnóstico de malária em amostras de campo, incluindo área não endêmica (n=117) e área endêmica para malária (n=163). Os resultados revelaram que os protocolos de RT-Mangold,PCR-Demas e RT-LAMAL foram mais eficientes na detecção de parasitemias submicroscópicas, porém, o protocolo de RT-Mangold novamente mostrou ser incapaz de detectar infecções mistas. Em conjunto, os dados obtidos demonstraram que os alvos Pvr47/Pfr364 foram mais adequados para o diagnóstico molecular de malária vivax e falciparum do que o gene 18S rRNA. Contudo, o protocolo aqui desenvolvido (RT-LAMAL) se mostra em vantagem à PCR-Demas,com maior rapidez na obtenção de resultados, dispensando a revelação em gel deagarose e uso de brometo de etídeo, além de diminuir a possibilidade de contaminação de reagentes e amostras. Portanto, conclui-se que a RT-LAMAL possui grande potencial para o diagnóstico molecular de certeza de pacientes com infecções mistas e baixas parasitemias.

Brote de Plasmodium falciparum, en tropas guatemaltecas desplegada en misión de paz en República democrática del congo (RDC) / Plasmodium falciparum outbreak in Guatemalan troops deployed in peacekeeping mission in democratic republic of congo (DRC)

Antecedentes: La República de Guatemala desde el año 2003 ha sido parte de los contingentes de mantenimiento y estabilización de la paz en las Naciones Unidas, con tropas desplegadas en las Repúblicas de Haití y república Democrática del Congo. El 2 de noviembre de 2010, la Oficina Regional Para Centro América y Panamá de los Centros para el Control y Prevención de Enfermdades de Estados Unidos (CDC-CAP), recibió una llamada del Centro Médico Militar de la ciudad de Guatemala, respecto a un soldado recién regresado de la República democrática del Congo (CRD) con un cuadro de enfermedad febril muy sugerente de malaria. El paciente falleció 48 horas después de haber sido admitido al hospital...

Identidade de potenciais determinantes imunológicos de gravidade da malária humana / Immunological identity of potential determinants of the severity of human malaria

A malária é considerada uma das mais importantes doenças infecciosas do mundo. Esta doença é causada por diversas espécies do protozoário Plasmodium sp., principalmente o Plasmodium falciparum e o Plasmodium vivax, transmitido por mosquitos do gênero Anopheles. Apesar dos esforços governamentais e privados para o desenvolvimento de estratégias para o controle da doença, o panorama atual da malária está piorando, muito em razão do aparecimento de cepas de parasitas resistentes aos medicamentos. Os casos fatais são relatados principalmente na África e são causados pelo Plasmodium falciparum. Apesar de ser menos letal, a malária causada pelo Plasmodium vivax é mais amplamente distribuída e pode apresentar também alta morbidage e mortalidade. Na maioria das áreas endêmicas, estudos têm identificado vários fatores relacionados à imunidade clínica ou susceptibilidade aos parasitas. Assim, pelo menos quanto à malária causada pelo Plasmodium falciparum, idade, polimorfismos genéticos e exposição repetida ao parasita são considerados importantes determinantes da evolução da doença. Infelizmente, pouco tem sido feito na identificação de fatores preditores consistentes que poderiam ser usados para avaliação clínica. Este quadro é ainda pior para malária causada pelo Plasmodium vivax, provavelmente porque muitos pesquisadores consideram que é uma doença benigna. Além disso, como a maioria do conhecimento atual sobre a patogênese da malária não ajudou a reduzir a ocorrência da infecção e suas complicações, novas abordagens são necessárias para superar este cenário desfavorável. Esta Tese reúne um conjunto de seis manuscritos que visam identificar potenciais determinantes da gravidade da malária em uma área endêmica da Amazônia Ocidental Brasileira...

A semi-automatic method for quantification and classification of erythrocytes infected with malaria parasites in microscopic images.

Visual quantification of parasitemia in thin blood films is a very tedious, subjective and time-consuming task. This study presents an original method for quantification and classification of erythrocytes in stained thin blood films infected with Plasmodium falciparum. The proposed approach is composed of three main phases: a preprocessing step, which corrects luminance differences. A segmentation step that uses the normalized RGB color space for classifying pixels either as erythrocyte or background followed by an Inclusion-Tree representation that structures the pixel information into objects, from which erythrocytes are found. Finally, a two step classification process identifies infected erythrocytes and differentiates the infection stage, using a trained bank of classifiers. Additionally, user intervention is allowed when the approach cannot make a proper decision. Four hundred fifty malaria images were used for training and evaluating the method. Automatic identification of infected erythrocytes showed a specificity of 99.7% and a sensitivity of 94%. The infection stage was determined with an average sensitivity of 78.8% and average specificity of 91.2%.

Papel dos receptores do tipo toll na malária / Role of toll-like receptors in malaria

Desde sua descoberta, os receptores do tipo Toll (TLRs) têm sido envolvidos em quase todas as doenças que afetam a saúde humana. Seu papel na proteção contra vários patógenos, incluindo protozoários está bem estabelecido. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel dos TLRs na malária. No presente estudo, investigamos o papel dos TLRs. durante a malária murina e humana. Nossos resultados mostraram que camundongos com deficiência para MyD88, um adaptador essencial para a sinalização dos TLRs, produzem níveis de citocinas pró-inflamatórias significativamente menores e apresentam sintomas mais amenos durante a infecção por Plasmodium chabaudi. Entretanto, estes animais retêm a capacidade de controlar a parasitemia sugerindo que os TLRs possuam um papel na patogênese e não na proteção contra a malária. Posteriormente, mostramos que ambas, a infecção natural humana por P. falciparum e a experimental murina por P. chabaudi, aumentam a expressão e a responsividade dos TLRs nas células do sistema imune inato. O estado hiper-responsivo das células durante a malária é derivado da ativação de TLR9 e a produção de IFN por células T, levando a uma alta susceptibilidade ao choque séptico durante a malária aguda. Finalmente, em colaboração com a EISAI Research Institute, desenvolvemos um antagonista de TLR9 e testamos seu efeito na Malária Cerebral (CM), uma das manifestações clínicas mais graves da malária. O tratamento oral com este composto inibiu os sintomas, tais como. extravasamento vascular cerebral, protegendo camundongos da morte por CM. Em conjunto, nossos resultados mostram um importante papel dos TLRs, especialmente TLR9, na patogênese da malária e que a intervenção na função destes receptores é uma potencial quimioterapia anti-inflamatória contra essa doença

Papel dos Receptores do tipo Toll na malária

Desde sua descoberta, os receptores do tipo Toll (TLRs) têm sido envolvidos em quase todas as doenças que afetam a saúde humana. Seu papel na proteção contra vários patógenos, incluindo protozoários está bem estabelecido. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel dos TLRs na malária. No presente estudo, investigamos o papel dos TLRs. durante a malária murina e humana. Nossos resultados mostraram que camundongos com deficiência para MyD88, um adaptador essencial para a sinalização dos TLRs, produzem níveis de citocinas pró-inflamatórias significativamente menores e apresentam sintomas mais amenos durante a infecção por Plasmodium chabaudi. Entretanto, estes animais retêm a capacidade de controlar a parasitemia sugerindo que os TLRs possuam um papel na patogênese e não na proteção contra a malária. Posteriormente, mostramos que ambas, a infecção natural humana por P. falciparum e a experimental murina por P. chabaudi, aumentam a expressão e a responsividade dos TLRs nas células do sistema imune inato. O estado hiper-responsivo das células durante a malária é derivado da ativação de TLR9 e a produção de IFN por células T, levando a uma alta susceptibilidade ao choque séptico durante a malária aguda. Finalmente, em colaboração com a EISAI Research Institute, desenvolvemos um antagonista de TLR9 e testamos seu efeito na Malária Cerebral (CM), uma das manifestações clínicas mais graves da malária. O tratamento oral com este composto inibiu os sintomas, tais como. extravasamento vascular cerebral, protegendo camundongos da morte por CM. Em conjunto, nossos resultados mostram um importante papel dos TLRs, especialmente TLR9, na patogênese da malária e que a intervenção na função destes receptores é uma potencial quimioterapia anti-inflamatória contra essa doença

[Concordance between thick blood smear, immunochromatography and polymerase chain reaction for malaria diagnosis]. / Concordancia entre gota gruesa, inmunocromatografía y reacción en cadena de la polimerasa para el diagnóstico de malaria.

INTRODUCTION: The rapid and effective diagnosis of malaria is the determining condition for an appropriate treatment and control of the disease. OBJECTIVE: The sensitivity, specificity and the positive and negative predictive values were evaluated in cases of suspected malaria in Colombia in a comparison of a rapid diagnostic test. the PCR test and the thick blood smear-the traditional gold standard. MATERIALS AND METHODS: A group of 100 patients with symptoms compatible with malaria, were included in the study. They were selected from the following Colombian regions: Urabá, Córdoba, lower Cauca, and relatively fewer from other malaria endemic areas of Colombia including the provinces of Valle, Chocó in the central west of Colombia and Vichada to the east. To each patient the following three tests were performed: the rapid OptiMAL test, the PCR identification and the thick blood smear. The PCR amplified specific DNA sequences with primers designed to identify the genus Plasmodium, and the two species present in Colombia, P. falciparum and P. vivax. RESULTS: The sensitivity of the rapid test versus the thick smear, for the diagnosis of both species of Plasmodium was 93.9% (95% CI: 87-100%) and the specificity was 94.3% (95% CI:.253 85-100%). The PCR compared with the thick smear showed a sensitivity of 100% (95% CI: 99-100%) and a specificity of 97.1% (95% CI: 90-100%). CONCLUSIONS: The sensitivity and specificity of the three tests did not present statistically significant differences. However, the thick blood smear was recommended as the standard test, mainly due to its low cost.

Evaluation of the OptiMAL® test for diagnosis of malaria in Venezuela

Se evaluó el test rápido OptiMAL® comparándolo con el examen convencional de observación de muestras sanguíneas para la detección de la malaria en dos grupos de individuos procedentes de diferentes áreas endémicas de Venezuela. Uno de los grupos (n = 113) con síntomas sugestivos de malaria, y otro representado por individuos asintomáticos (n = 89). El examen microscópico de las muestras de sangre de estas poblaciones determinó que 67,5 por ciento estaban infectados con P.vivax, 31,3 por ciento con P. falciparum y 1,2 por ciento con infecciones mixtas. La prueba OptiMAL® mostró 96,4 por ciento de sensibilidad, 100 por ciento de especificidad, con valor predictivo positivo de 100 por ciento y valor predictivo negativo de 97,5 por ciento. La detección de cualquier infección malárica en la población total presentó una concordancia óptima (kappa = 0,97). Sin embargo, estos parámetros fueron más bajos cuando la parasitemia era £ 300 parásitos/µL. El congelamiento de las muestras no afectó la sensibilidad y especificidad de la prueba. Nosotros concluimos que esta prueba rápida de malaria es sensible y especifica para el diagnóstico rápido de la malaria en el campo y puede complementar a la microcopia convencional.

Frequency of the HFE C282Y and H63D polymorphisms in Brazilian malaria patients and blood donors from the Amazon region.

Malaria is an endemic parasitosis and its causitive agent, Plasmodium, has a metabolism linked to iron supply. HFE is a gene with the polymorphisms C282Y and H63D, which are associated with a progressive iron accumulation in the organism leading to a disease called hereditary hemochromatosis. The aim of the present study was to determine the allelic and genotypic frequencies of the HFE gene polymorphisms in malaria patients and blood donors from the Brazilian Amazon region. We screened 400 blood donors and 400 malaria patients for the HFE C282Y and H63D polymorphisms from four states of the Brazilian Amazon region by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis. We did not find any C282Y homozygous individuals, and the only five heterozygous individuals detected were from Pará State. The most frequent genotype in the North region of Brazil was the H63D heterozygote, in both study groups. Our results contribute to the concept that the Brazilian Amazon region should not be regarded as a single entity in South America. These polymorphisms did not influence the symptoms of malaria in the population studied, as neither severe signs nor high parasitemia were observed. Therefore, different hereditary hemochromatosis diagnostic and control measures must be developed and applied within its diverse locations. Investigations are currently being carried out in our laboratory in order to determine the importance of the coexistence of hereditary hemochromatosis in patients affected by parasitic diseases, such as malaria.

Frequency of the HFE C282Y and H63D polymorphisms in Brazilian malaria patients and blood donors from the Amazon region

Malaria is an endemic parasitosis and its causitive agent, Plasmodium, has a metabolism linked to iron supply. HFE is a gene with the polymorphisms C282Y and H63D, which are associated with a progressive iron accumulation in the organism leading to a disease called hereditary hemochromatosis. The aim of the present study was to determine the allelic and genotypic frequencies of the HFE gene polymorphisms in malaria patients and blood donors from the Brazilian Amazon region. We screened 400 blood donors and 400 malaria patients for the HFE C282Y and H63D polymorphisms from four states of the Brazilian Amazon region by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis. We did not find any C282Y homozygous individuals, and the only five heterozygous individuals detected were from Pará State. The most frequent genotype in the North region of Brazil was the H63D heterozygote, in both study groups. Our results contribute to the concept that the Brazilian Amazon region should not be regarded as a single entity in South America. These polymorphisms did not influence the symptoms of malaria in the population studied, as neither severe signs nor high parasitemia were observed. Therefore, different hereditary hemochromatosis diagnostic and control measures must be developed and applied within its diverse locations. Investigations are currently being carried out in our laboratory in order to determine the importance of the coexistence of hereditary hemochromatosis in patients affected by parasitic diseases, such as malaria.

Quimioterapia antimalárica experimental e mecanismos de ação de antimaláricos envolvendo íons cálcio e prótons / Experimental chemotherapy and antimalarial mechanisms of action of antimalarial drugs involving calcium ions and protons

Limitações atuais do arsenal terapêutico na malária humana exigem a busca de novos medicamentos. Além da grande importância econômica e social da malária e da resistência do P. falciparum a cloroquina e outros derivados quinolínicos, as associações medicamentosas compostas por artemisinina e seus derivados apresentam custos de produção elevados, dificultando seu emprego em regiões em desenvolvimento, especialmente no continente africano. Nesse trabalho testamos a atividade antimalárica de: (i) associações dos antimaláricos artesunato (AS) e mefloquina (MQ) com ciprofloxacina, uma fluoroquinolona sintética empregada contra infecções bacterianas; (ii) moléculas obtidas por síntese química, como anti-retrovrais, endoperóxidos, e uma nova molécula híbrida denominada MEFAS e (iii) extratos e compostos purificados de plantas medicinais como falsas quinas e Holostylis reniformis, utilizadas popularmente no tratamento de quadros febris e dispepsias. Os testes esquizonticidas foram feitos em cultivos contínuos de P. falciparum avaliando-se o crescimento das fases intraeritrocitárias através de duas metodologias (teste tradicional ou o ensaio de incorporação de hipoxantina tritiada); e utilizando camundongos inoculados com P. berghei. Estabelecemos ainda um protocolo com sondas fluorescentes que permitiu trabalhar com trofozoítos de P. falciparum viáveis em eritrócitos infectados e acompanhar, em tempo real, ações de potenciais antimaláricos sobre a homeostasia iônica dos parasitos, identificando possíveis alvos intracelulares dos mesmos.

Quimioterapia antimalárica experimental e mecanismos de ação de antimaláricos envolvendo íons cálcio e prótons

Limitações atuais do arsenal terapêutico na malária humana exigem a busca de novos medicamentos. Além da grande importância econômica e social da malária e da resistência do P. falciparum a cloroquina e outros derivados quinolínicos, as associações medicamentosas compostas por artemisinina e seus derivados apresentam custos de produção elevados, dificultando seu emprego em regiões em desenvolvimento, especialmente no continente africano. Nesse trabalho testamos a atividade antimalárica de: (i) associações dos antimaláricos artesunato (AS) e mefloquina (MQ) com ciprofloxacina, uma fluoroquinolona sintética empregada contra infecções bacterianas; (ii) moléculas obtidas por síntese química, como anti-retrovrais, endoperóxidos, e uma nova molécula híbrida denominada MEFAS e (iii) extratos e compostos purificados de plantas medicinais como falsas quinas e Holostylis reniformis, utilizadas popularmente no tratamento de quadros febris e dispepsias. Os testes esquizonticidas foram feitos em cultivos contínuos de P. falciparum avaliando-se o crescimento das fases intraeritrocitárias através de duas metodologias (teste tradicional ou o ensaio de incorporação de hipoxantina tritiada); e utilizando camundongos inoculados com P. berghei. Estabelecemos ainda um protocolo com sondas fluorescentes que permitiu trabalhar com trofozoítos de P. falciparum viáveis em eritrócitos infectados e acompanhar, em tempo real, ações de potenciais antimaláricos sobre a homeostasia iônica dos parasitos, identificando possíveis alvos intracelulares dos mesmos.

Observamos um sinergismo das associações de MQ e/ou AS com ciprofloxacina, combinações essas que representam uma alternativa promissora para o tratamento da malária humana, assim como os anti-retrovirais testados, todos parcialmente ativos. MEFAS, uma nova molécula híbrida entre os antimaláricos MQ e AS mostrou intensa ação antimalárica in vitro e in vivo. Estudos do mecanismo de ação através de microscopia confocal da MEFAS mostram que a molécula atua simultâneamente em dois compartimentos intracelulares de P. falciparum, o retículo endoplasmático liso e o vacúolo digestivo. Dois endoperóxidos sintéticos derivados do ácido abiético, também ativos na malária, agiram sobre o retículo endoplasmático liso do parasito, mas necessitam de modificações químicas visando potenciar sua ação esquizonticida. Avaliamos ainda a atividade farmacológica de extratos de R. ferruginea e S. pseudoquina que inibiram parcialmente a parasitemia em camundongos e/ou o crescimento de P. falciparum in vitro e de lignanas isoladas de H. renformis que mostrou intensa atividade antimalárica. O conhecimento científico gerado neste trabalho deverá contribuir para a formulação de novos fármacos com ação antimalárica seletiva

Mutations in the pfmdr1, cg2, and pfcrt genes in Plasmodium falciparum samples from endemic malaria areas in Rondonia and Pará State, Brazilian Amazon Region / Mutações nos genes pfmdr1, cg2 e pfcrt em isolados de Plasmodium falciparum provenientes de localidades malarígenas dos Estados de Rondônia e Pará, Amazônia Legal Brasileira

The objectives of this study were to investigate the molecular basis for Plasmodium falciparum resistance to chloroquine in isolates from the Brazilian Amazon and to identify polymorphisms in the pfmdr1 gene, codons 184, 1042, and 1246, the kappa and gamma regions of the cg2 gene, and the K76T mutation of the pfcrt gene, in order to calculate the distribution of polymorphism within each target gene, comparing samples from distinct geographic areas, using allele-specific polymerase chain reaction (PCR) for the pfmdr gene and PCR plus restriction fragment length polymorphism (RFLP) for the cg2 and pfcrt genes. The sample consisted of 40 human blood isolates, already collected and morphologically diagnosed as carriers of P. falciparum parasites, from four localities: Porto Velho in Rondonia State and Maraba, Itaituba, and Tailandia in Pará State. Distribution of P. falciparum in vitro chloroquine resistance in the isolates was 100 percent for pfmdr1, cg2 gamma region, and pfcrt, except for the polymorphism in the cg2 kappa region, which was not found.

O estudo foi desenvolvido para investigar a base molecular da resistência do Plasmodium falciparum à cloroquina em isolados da região Amazônica brasileira e identificar os polimorfismos nos códons TYR184PHE, ASN1042ASP e ASP1246TYR do gene pfmdr1, as regiões kappa e gamma do gene cg2 e a mutação K76T do gene pfcrt, a fim de determinar a distribuição percentual dos alelos de cada gene estudado, comparando amostras de áreas geográficas distintas, utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) alelo-específica para o pfmdr1 e a PCR e o polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (RFLP) para os genes cg2 e pfcrt. A amostra foi constituída de quarenta isolados de sangue humano já coletados e microscopicamente diagnosticados com malária por P. falciparum das localidades de Porto Velho (Rondônia) e Marabá, Itaituba e Tailândia (Pará). A distribuição percentual da resistência in vitro do P. falciparum à cloroquina nas amostras estudadas foi de 100 por cento de resistência para os genes pfmdr1, região gamma do cg2 e pfcrt. O polimorfismo na região kappa do gene cg2 não foi encontrado nas amostras estudadas.