ß-amino acids reduce ternary complex stability and alter the translation elongation mechanism.

Templated synthesis of proteins containing non-natural amino acids (nnAAs) promises to vastly expand the chemical space available to biological therapeutics and materials. Existing technologies limit the identity and number of nnAAs than can be incorporated into a given protein. Addressing these bottlenecks requires deeper understanding of the mechanism of messenger RNA (mRNA) templated protein synthesis and how this mechanism is perturbed by nnAAs. Here we examine the impact of both monomer backbone and side chain on formation and ribosome-utilization of the central protein synthesis substate: the ternary complex of native, aminoacylated transfer RNA (aa-tRNA), thermally unstable elongation factor (EF-Tu), and GTP. By performing ensemble and single-molecule fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements, we reveal the dramatic effect of monomer backbone on ternary complex formation and protein synthesis. Both the (R) and (S)-ß2 isomers of Phe disrupt ternary complex formation to levels below in vitro detection limits, while (R)- and (S)-ß3-Phe reduce ternary complex stability by approximately one order of magnitude. Consistent with these findings, (R)- and (S)-ß2-Phe-charged tRNAs were not utilized by the ribosome, while (R)- and (S)-ß3-Phe stereoisomers were utilized inefficiently. The reduced affinities of both species for EF-Tu ostensibly bypassed the proofreading stage of mRNA decoding. (R)-ß3-Phe but not (S)-ß3-Phe also exhibited order of magnitude defects in the rate of substrate translocation after mRNA decoding, in line with defects in peptide bond formation that have been observed for D-α-Phe. We conclude from these findings that non-natural amino acids can negatively impact the translation mechanism on multiple fronts and that the bottlenecks for improvement must include consideration of the efficiency and stability of ternary complex formation.

Hyper-swivel head domain motions are required for complete mRNA-tRNA translocation and ribosome resetting.

Translocation of messenger RNA (mRNA) and transfer RNA (tRNA) substrates through the ribosome during protein synthesis, an exemplar of directional molecular movement in biology, entails a complex interplay of conformational, compositional, and chemical changes. The molecular determinants of early translocation steps have been investigated rigorously. However, the elements enabling the ribosome to complete translocation and reset for subsequent protein synthesis reactions remain poorly understood. Here, we have combined molecular simulations with single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging to gain insights into the rate-limiting events of the translocation mechanism. We find that diffusive motions of the ribosomal small subunit head domain to hyper-swivelled positions, governed by universally conserved rRNA, can maneuver the mRNA and tRNAs to their fully translocated positions. Subsequent engagement of peptidyl-tRNA and disengagement of deacyl-tRNA from mRNA, within their respective small subunit binding sites, facilitate the ribosome resetting mechanism after translocation has occurred to enable protein synthesis to resume.

Diffusion control in biochemical specificity.

Biochemical specificity is critical in enzyme function, evolution, and engineering. Here we employ an established kinetic model to dissect the effects of reactant geometry and diffusion on product formation speed and accuracy in the presence of cognate (correct) and near-cognate (incorrect) substrates. Using this steady-state model for spherical geometries, we find that, for distinct kinetic regimes, the speed and accuracy of the reactions are optimized on different regions of the geometric landscape. From this model we deduce that accuracy can be strongly dependent on reactant geometric properties even for chemically limited reactions. Notably, substrates with a specific geometry and reactivity can be discriminated by the enzyme with higher efficacy than others through purely diffusive effects. For similar cognate and near-cognate substrate geometries (as is the case for polymerases or the ribosome), we observe that speed and accuracy are maximized in opposing regions of the geometric landscape. We also show that, in relevant environments, diffusive effects on accuracy can be substantial even far from extreme kinetic conditions. Finally, we find how reactant chemical discrimination and diffusion can be related to simultaneously optimize steady-state flux and accuracy. These results highlight how diffusion and geometry can be employed to enhance reaction speed and discrimination, and similarly how they impose fundamental restraints on these quantities.

Miscoding-induced stalling of substrate translocation on the bacterial ribosome.

Directional transit of the ribosome along the messenger RNA (mRNA) template is a key determinant of the rate and processivity of protein synthesis. Imaging of the multistep translocation mechanism using single-molecule FRET has led to the hypothesis that substrate movements relative to the ribosome resolve through relatively long-lived late intermediates wherein peptidyl-tRNA enters the P site of the small ribosomal subunit via reversible, swivel-like motions of the small subunit head domain within the elongation factor G (GDP)-bound ribosome complex. Consistent with translocation being rate-limited by recognition and productive engagement of peptidyl-tRNA within the P site, we now show that base-pairing mismatches between the peptidyl-tRNA anticodon and the mRNA codon dramatically delay this rate-limiting, intramolecular process. This unexpected relationship between aminoacyl-tRNA decoding and translocation suggests that miscoding antibiotics may impact protein synthesis by impairing the recognition of peptidyl-tRNA in the small subunit P site during EF-G-catalyzed translocation. Strikingly, we show that elongation factor P (EF-P), traditionally known to alleviate ribosome stalling at polyproline motifs, can efficiently rescue translocation defects arising from miscoding. These findings help reveal the nature and origin of the rate-limiting steps in substrate translocation on the bacterial ribosome and indicate that EF-P can aid in resuming translation elongation stalled by miscoding errors.

Multiperspective smFRET reveals rate-determining late intermediates of ribosomal translocation.

Directional translocation of the ribosome through the mRNA open reading frame is a critical determinant of translational fidelity. This process entails a complex interplay of large-scale conformational changes within the actively translating particle, which together coordinate the movement of tRNA and mRNA substrates with respect to the large and small ribosomal subunits. Using pre-steady state, single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, we tracked the nature and timing of these conformational events within the Escherichia coli ribosome from five structural perspectives. Our investigations revealed direct evidence of structurally and kinetically distinct late intermediates during substrate movement, whose resolution determines the rate of translocation. These steps involve intramolecular events within the EF-G-GDP-bound ribosome, including exaggerated, reversible fluctuations of the small-subunit head domain, which ultimately facilitate peptidyl-tRNA's movement into its final post-translocation position.

Functional Dynamics within the Human Ribosome Regulate the Rate of Active Protein Synthesis.

The regulation of protein synthesis contributes to gene expression in both normal physiology and disease, yet kinetic investigations of the human translation mechanism are currently lacking. Using single-molecule fluorescence imaging methods, we have quantified the nature and timing of structural processes in human ribosomes during single-turnover and processive translation reactions. These measurements reveal that functional complexes exhibit dynamic behaviors and thermodynamic stabilities distinct from those observed for bacterial systems. Structurally defined sub-states of pre- and post-translocation complexes were sensitive to specific inhibitors of the eukaryotic ribosome, demonstrating the utility of this platform to probe drug mechanism. The application of three-color single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) methods further revealed a long-distance allosteric coupling between distal tRNA binding sites within ribosomes bearing three tRNAs, which contributed to the rate of processive translation.

Small-molecule photostabilizing agents are modifiers of lipid bilayer properties.

Small-molecule photostabilizing or protective agents (PAs) provide essential support for the stability demands on fluorescent dyes in single-molecule spectroscopy and fluorescence microscopy. These agents are employed also in studies of cell membranes and model systems mimicking lipid bilayer environments, but there is little information about their possible effects on membrane structure and physical properties. Given the impact of amphipathic small molecules on bilayer properties such as elasticity and intrinsic curvature, we investigated the effects of six commonly used PAs--cyclooctatetraene (COT), para-nitrobenzyl alcohol (NBA), Trolox (TX), 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO), para-nitrobenzoic acid (pNBA), and n-propyl gallate (nPG)--on bilayer properties using a gramicidin A (gA)-based fluorescence quench assay to probe for PA-induced changes in the gramicidin monomer↔dimer equilibrium. The experiments were done using fluorophore-loaded large unilamellar vesicles that had been doped with gA, and changes in the gA monomer↔dimer equilibrium were assayed using a gA channel-permeable fluorescence quencher (Tl⁺). Changes in bilayer properties caused by, e.g., PA adsorption at the bilayer/solution interface that alter the equilibrium constant for gA channel formation, and thus the number of conducting gA channels in the large unilamellar vesicle membrane, will be detectable as changes in the rate of Tl⁺ influx-the fluorescence quench rate. Over the experimentally relevant millimolar concentration range, TX, NBA, and pNBA, caused comparable increases in gA channel activity. COT, also in the millimolar range, caused a slight decrease in gA channel activity. nPG increased channel activity at submillimolar concentrations. DABCO did not alter gA activity. Five of the six tested PAs thus alter lipid bilayer properties at experimentally relevant concentrations, which becomes important for the design and analysis of fluorescence studies in cells and model membrane systems. We therefore tested combinations of COT, NBA, and TX; the combinations altered the fluorescence quench rate less than would be predicted assuming their effects on bilayer properties were additive. The combination of equimolar concentrations of COT and NBA caused minimal changes in the fluorescence quench rate.

Elongation factor Ts directly facilitates the formation and disassembly of the Escherichia coli elongation factor Tu·GTP·aminoacyl-tRNA ternary complex.

BACKGROUND: Aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) enters the ribosome in a ternary complex with the G-protein elongation factor Tu (EF-Tu) and GTP. RESULTS: EF-Tu·GTP·aa-tRNA ternary complex formation and decay rates are accelerated in the presence of the nucleotide exchange factor elongation factor Ts (EF-Ts). CONCLUSION: EF-Ts directly facilitates the formation and disassociation of ternary complex. SIGNIFICANCE: This system demonstrates a novel function of EF-Ts. Aminoacyl-tRNA enters the translating ribosome in a ternary complex with elongation factor Tu (EF-Tu) and GTP. Here, we describe bulk steady state and pre-steady state fluorescence methods that enabled us to quantitatively explore the kinetic features of Escherichia coli ternary complex formation and decay. The data obtained suggest that both processes are controlled by a nucleotide-dependent, rate-determining conformational change in EF-Tu. Unexpectedly, we found that this conformational change is accelerated by elongation factor Ts (EF-Ts), the guanosine nucleotide exchange factor for EF-Tu. Notably, EF-Ts attenuates the affinity of EF-Tu for GTP and destabilizes ternary complex in the presence of non-hydrolyzable GTP analogs. These results suggest that EF-Ts serves an unanticipated role in the cell of actively regulating the abundance and stability of ternary complex in a manner that contributes to rapid and faithful protein synthesis.

Actividad cognitivo-conductual de sujetos expuestos a las radiaciones electromagnéticas (radiaciones no ionizantes) / Cognitive behavioural activity of subjects exposed to electromagnetic radiations ( non-ionizing radiations)

Se ha confirmado que la exposición a las radiaciones electromagnéticas (radiaciones de microondas) provoca cambios en el sistema nervioso central, como dolor de cabeza, fatiga, debilidad general, sensación de mareos, mal humor, confusión, insomnio, depresión, pérdida de la memoria y hasta intentos suicidas juntos con cambios en la esfera cognitiva. Este complejo sintomático se ha denominado como el síndrome de las radiofrecuencias. El trabajo persigue el objetivo de dar a conocer la influencia del campo electromagnético sobre la actividad psíquica en un grupo de sujetos de las tropas radiotécnicas, que se compararon con un grupo control no perteneciente a esa especialidad. El estudio abarcó una evaluación psiquiátrica y psicológica, y utilizó la historia clínica de encuesta y aplicación de un grupo de test psicológicos. Se demostró un aumento del número de sujetos expuestos con memoria disminuida, mayor número de sujetos con estado de ansiedad grave y depresión en relación con el grupo control

Actividad cognitivo-conductual de sujetos expuestos a las radiaciones electromagnéticas (radiaciones no ionizantes) / Cognitive behavioural activity of subjects exposed to electromagnetic radiations ( non-ionizing radiations)

Se ha confirmado que la exposición a las radiaciones electromagnéticas (radiaciones de microondas) provoca cambios en el sistema nervioso central, como dolor de cabeza, fatiga, debilidad general, sensación de mareos, mal humor, confusión, insomnio, depresión, pérdida de la memoria y hasta intentos suicidas juntos con cambios en la esfera cognitiva. Este complejo sintomático se ha denominado como el síndrome de las radiofrecuencias. El trabajo persigue el objetivo de dar a conocer la influencia del campo electromagnético sobre la actividad psíquica en un grupo de sujetos de las tropas radiotécnicas, que se compararon con un grupo control no perteneciente a esa especialidad. El estudio abarcó una evaluación psiquiátrica y psicológica, y utilizó la historia clínica de encuesta y aplicación de un grupo de test psicológicos. Se demostró un aumento del número de sujetos expuestos con memoria disminuida, mayor número de sujetos con estado de ansiedad grave y depresión en relación con el grupo control(AU)

Evaluación neurovegetativa cardiovascular ("neuromega") en personal expuesto a las radiaciones electromagnéticas (radiaciones no ionizantes) / Cardiovascular neurovegetative evaluation (

El sistema neuromega permite entre otras posibilidades, de manera automatizada con registros electrocardiográficos grabados digitalmente, el análisis de los intervalos R-R del complejo QRST del electrocardiograma. Las principales herramientas que emplea son los histogramas secuenciales y no secuenciales de los cardiointervalos y el análisis de diferentes índices descriptivos de la distribución de esos intervalos. El propósito del presente trabajo fue evaluar la actividad neurovegetativa cardiovascular mediante el sistema "neuromega" en personal expuesto a las radiaciones electromagnéticas y compararla con la de un grupo control. Alteraciones como el recorrido o amplitud máxima de la dispersión que depende principalmente de la actividad de los nervios vagos, amplitud de la moda, que refleja el efecto de la influencia estabilizadora de la regulación central sobre el ritmo cardiaco, se correlacionan con la homeostasis vegetativa y el automatismo cardiaco, ambos evaluadores del equilibrio neurovegetativo basal, que en este estudio presentó predominio parasimpático

Evaluación neurovegetativa cardiovascular ("neuromega") en personal expuesto a las radiaciones electromagnéticas (radiaciones no ionizantes) / Cardiovascular neurovegetative evaluation ("neuromega") in personnel exposed to electromagnetic radiations (non-ionizing radiations

El sistema "neuromega" permite entre otras posibilidades, de manera automatizada con registros electrocardiográficos grabados digitalmente, el análisis de los intervalos R-R del complejo QRST del electrocardiograma. Las principales herramientas que emplea son los histogramas secuenciales y no secuenciales de los cardiointervalos y el análisis de diferentes índices descriptivos de la distribución de esos intervalos. El propósito del presente trabajo fue evaluar la actividad neurovegetativa cardiovascular mediante el sistema "neuromega" en personal expuesto a las radiaciones electromagnéticas y compararla con la de un grupo control. Alteraciones como el recorrido o amplitud máxima de la dispersión que depende principalmente de la actividad de los nervios vagos, amplitud de la moda, que refleja el efecto de la influencia estabilizadora de la regulación central sobre el ritmo cardiaco, se correlacionan con la homeostasis vegetativa y el automatismo cardiaco, ambos evaluadores del equilibrio neurovegetativo basal, que en este estudio presentó predominio parasimpático(AU)

Evaluación electroencefalográfica en personas expuestas a las radiaciones electromagnéticas (radiaciones no ionizantes) / Electroencephalographic evaluation of persons exposed to electromagnetic radiations (non-ionizing radiations)

Las radiaciones electromagnéticas según diferentes autores pueden modificar la actividad bioeléctrica cerebral y producir cambios en el electroencefalograma mediante diferentes mecanismos biológicos que involucran a los iones calcio, la producción de melatonina y otras funciones neurorreguladoras. El objetivo del presente estudio fue evaluar el electroencefalograma en un grupo de personas expuestas a las radiaciones electromagnéticas y compararlo con un grupo no expuesto. Se encontró que en los expuestos las alteraciones electroencefalográficas más frecuentes fueron las que manifestaron un sufrimiento cortical cerebral (alteraciones lentas), un aumento de energía absoluta y total de las bandas electroencefalográficas theta y delta, mientras que las alteraciones del electroencefalograma encontradas en los controles no difieren por su número y características morfológicas de las encontradas en la población en general

Evaluación electroencefalográfica en personas expuestas a las radiaciones electromagnéticas (radiaciones no ionizantes) / Electroencephalographic evaluation of persons exposed to electromagnetic radiations (non-ionizing radiations)

Las radiaciones electromagnéticas según diferentes autores pueden modificar la actividad bioeléctrica cerebral y producir cambios en el electroencefalograma mediante diferentes mecanismos biológicos que involucran a los iones calcio, la producción de melatonina y otras funciones neurorreguladoras. El objetivo del presente estudio fue evaluar el electroencefalograma en un grupo de personas expuestas a las radiaciones electromagnéticas y compararlo con un grupo no expuesto. Se encontró que en los expuestos las alteraciones electroencefalográficas más frecuentes fueron las que manifestaron un sufrimiento cortical cerebral (alteraciones lentas), un aumento de energía absoluta y total de las bandas electroencefalográficas theta y delta, mientras que las alteraciones del electroencefalograma encontradas en los controles no difieren por su número y características morfológicas de las encontradas en la población en general(AU)

El balance redox en personas expuestas a las radiaciones electromagnéticas (radiaciones no ionizantes) / Redox balance in people exposed to electromagnetic radiations (non-ionizing radiations)

Las ondas electromagnéticas emitidas por campos con frecuencias ultra altas (0,3-3 Ghz) conllevan el peligro de efectos biológicos que pueden convertirse en efectos adversos para la salud. Uno de estos efectos adversos es el desbalance redox con incremento en la producción de radicales libres y la disminución de las defensas antioxidantes. Por tal motivo el objetivo del trabajo consistió en conocer la influencia de las radiaciones electromagnéticas sobre un grupo de personas expuestas y compararla con otro grupo no expuesto tomado como control. Se denota un incremento de la superóxido dismutasa, un incremento de H2O2, una disminución de la capacidad antioxidante total del plasma, un aumento de malondialdehído y no cambios en la concentración de catalasa en los sujetos expuestos. Se concluye que en estos se produce un desbalance redox

El balance redox en personas expuestas a las radiaciones electromagnéticas (radiaciones no ionizantes) / Redox balance in people exposed to electromagnetic radiations (non-ionizing radiations)

Las ondas electromagnéticas emitidas por campos con frecuencias ultra altas (0,3-3 Ghz) conllevan el peligro de efectos biológicos que pueden convertirse en efectos adversos para la salud. Uno de estos efectos adversos es el desbalance redox con incremento en la producción de radicales libres y la disminución de las defensas antioxidantes. Por tal motivo el objetivo del trabajo consistió en conocer la influencia de las radiaciones electromagnéticas sobre un grupo de personas expuestas y compararla con otro grupo no expuesto tomado como control. Se denota un incremento de la superóxido dismutasa, un incremento de H2O2, una disminución de la capacidad antioxidante total del plasma, un aumento de malondialdehído y no cambios en la concentración de catalasa en los sujetos expuestos. Se concluye que en estos se produce un desbalance redox(AU)

Espermatogénesis en personal profesional expuestos a las radiaciones electromagnéticas / Spermatogenesis in the professional personnel exposed to electromagnetic radiations

La presencia en el ambiente laboral de las radiaciones no ionizantes con frecuencias de ondas entre los 100 a 300 Ghz se remonta solo a algunos decenios y está asociada con el progreso científico-técnico. Estas radiaciones afectan a sistemas, órganos y mecanismos bioquímicos, y comprometen la salud de los expuestos. Con el objetivo de conocer cómo influyen estas ondas electromagnéticas sobre la espermatogénesis, se realizó un estudio del semen en 125 profesionales de instituciones cerradas distribuidos en casos y controles, seleccionados aleatoriamente y divididos en 2 grupos de 63 y 62 respectivamente. Los valores estimados de riesgo relativo (OR) indican que el grupo expuesto al campo electromagnético tiene más probabilidad de presentar alteraciones del espermiograma

Espermatogénesis en personal profesional expuestos a las radiaciones electromagnéticas / Spermatogenesis in the professional personnel exposed to electromagnetic radiations

La presencia en el ambiente laboral de las radiaciones no ionizantes con frecuencias de ondas entre los 100 a 300 Ghz se remonta solo a algunos decenios y está asociada con el progreso científico-técnico. Estas radiaciones afectan a sistemas, órganos y mecanismos bioquímicos, y comprometen la salud de los expuestos. Con el objetivo de conocer cómo influyen estas ondas electromagnéticas sobre la espermatogénesis, se realizó un estudio del semen en 125 profesionales de instituciones cerradas distribuidos en casos y controles, seleccionados aleatoriamente y divididos en 2 grupos de 63 y 62 respectivamente. Los valores estimados de riesgo relativo (OR) indican que el grupo expuesto al campo electromagnético tiene más probabilidad de presentar alteraciones del espermiograma(AU)