Identification of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli strains by immunoserological detection of intimin.

AIMS: To evaluate the sensitivity and specificity of polyclonal and monoclonal antibodies (Mabs) against intimin in the detection of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli isolates using immunoblotting. METHODS AND RESULTS: Polyclonal and Mabs against the intimin-conserved region were raised, and their reactivities were compared in enteropathogenic E. coli (EPEC) and enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) isolates using immunoblotting analysis. In comparison with rat antiserum, rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction had a stronger recognition pattern to a wide spectrum of intimin types in different EPEC and EHEC serotypes. On the other hand, murine monoclonal IgG2b specific to intimin, with dissociation constant of 1.3x10(-8) mol l(-1), failed in the detection of some of these isolates. CONCLUSION: All employed antibodies showed 100% specificity, not reacting with any of the eae-negative isolates. The sensitivity range was according to the employed antisera, and 97% for rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction, followed by 92% and 78% sensitivity with rat antisera and Mab. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: The rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction in immunoblotting analysis is a useful tool for EPEC and EHEC diagnoses.

Identification of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli strains by immunoserological detection of intimin

To evaluate the sensitivity and specificity of polyclonal and monoclonalantibodies (Mabs) against intimin in the detection of enteropathogenic andenterohaemorrhagic Escherichia coli isolates using immunoblotting.Polyclonal and Mabs against the intimin-conservedregion were raised, and their reactivities were compared in enteropathogenic E. coli (EPEC) and enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) isolates using immunoblotting analysis. In comparison with rat antiserum, rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction had a stronger recognition pattern to a wide spectrum of intimin types in different EPEC and EHEC serotypes. On the other hand, murine monoclonal IgG2b specific to intimin, with dissociation constant of1Æ3 · 10)8 mol l)1, failed in the detection of some of these isolates. All employed antibodies showed 100% specificity, not reacting with any of the eae-negative isolates. The sensitivity range was according to the employed antisera, and 97% for rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction, followed by 92% and 78% sensitivity with rat antisera and Mab. Significance and Impact of the Study: The rabbit anti-intimin IgG-enriched fraction in immunoblotting analysis is a useful tool for EPEC and EHEC diagnoses.

Shiga toxin-producing Escherichia coli and atypical enteropathogenic Escherichia coli strains isolated from healthy sheep of different populations in São Paulo, Brazil.

AIMS: Sheep are important carriers of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) in several countries. However, there are a few reports about ovine STEC in American continent. METHODS AND RESULTS: About 86 E. coli strains previously isolated from 172 healthy sheep from different farms were studied. PCR was used for detection of stx(1), stx(2), eae, ehxA and saa genes and for the identification of intimin subtypes. Restriction fragment length polymorphism (RFLP)-PCR was performed to investigate the variants of stx(1) and stx(2), and the flagellar antigen (fliC) genes in nonmotile isolates. Five isolates were eae(+) and stx(-), and belonged to serotypes O128:H2/beta-intimin (2), O145:H2/gamma, O153:H7/beta and O178:H7/epsilon. Eighty-one STEC isolates were recovered, and the stx genotypes identified were stx(1c)stx(2d-O118) (46.9%), stx(1c) (27.2%), stx(2d-O118) (23.4%), and stx(1c)stx(2dOX3a) (2.5%). Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) revealed 27 profiles among 53 STEC and atypical enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) isolates. CONCLUSIONS: This study demonstrated that healthy sheep in São Paulo, Brazil, can be carriers of potential human pathogenic STEC and atypical EPEC. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: As some of the STEC serotypes presently found have been involved with haemolytic uraemic syndrome (HUS) in other countries, the important role of sheep as sources of STEC infection in our settings should not be disregarded.

Frequency of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) isolates among diarrheic and non-diarrheic calves in Brazil.

The occurrence of Shiga toxin (Stx) gene sequences was examined in 344 fecal samples from diarrheic (n=139) and non-diarrheic (n=205) calves from 12 beef farms in São Paulo State, Brazil to study the prevalence of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) strains. Forty-four (12.7%) animals were found to be positive for stx. The frequency of carriage of stx was higher in diarrheic calves (28/139, 20%) than in non-diarrheic animals (16/205, 7.8%) (P<0.001). Among the 24 STEC strains recovered from the animals, 12 isolates carried stx1, four stx2, and 8 carried both stx1 and stx2 genes. The eae and the enterohaemolysin (Ehly) gene sequences occurred at high frequencies in these STEC strains (41.6 and 50.0%, respectively). A total of 16 serotypes were identified. The serotypes O111:NM (four isolates), O111:H8 (two) and O118:H16 (one), currently described as enterohaemorrhagic E. coli (EHEC), were isolated from cattle in Brazil for the first time. These findings reinforce the importance of cattle as a reservoir of EHEC strains in Brazil.

Determination of the clonal structure of avian Escherichia coli strains by isoenzyme and ribotyping analysis.

Forty-nine avian Escherichia coli strains isolated from different outbreak cases of septicemia (24), swollen head syndrome (14) and omphalitis (11), and 20 strains isolated from poultry with no signs of the mentioned illnesses, for a total of 69 strains, were typed by isoenzyme profile and ribotyping analysis by restriction fragment length polymorphism (RFLP). Isoenzyme analysis discriminated better among strains (0-0.07 degree of genetic dissimilarity) than ribotyping analysis (0- 0.02 degree of genetic dissimilarity). The enzyme profiles of the E. coli isolates allowed the identification of 33 clones that were organized into six main clusters (A-F). Cluster A comprised 87% of the pathogenic strains and had no commensal strains, while commensal strains were assigned to clusters B-F. The ribotyping analysis resulted in a more heterogenous distribution of strains but most of those that cause the same type of infection were kept close together. Taken as a whole, these results demonstrate that pathogenic clones are more similar to one another when compared with commensal strains and suggest a correlation between the genetic background and the pathogenic characteristics of avian pathogenic E. coli strains.

Evaluation of an oil emulsified vaccine against bovine colibacillosis using semi-purified K99-F41 adhesins

Os antígenos K99-F41 foram extraídos da amostra de Escherichia coli B41 por aquecimento e semi-purificados pela precipitaçäo com sulfato de amônio e tratamento com desoxicolato de sódio (DOC). Os antígenos semi-purificados foram utilizados na produçäo de uma vacina oleosa contra a colibacilose bovina. Foram preparadas vacinas contendo em cada dose 1.500 HU (Unidades Hemaglutinantes), 750 HU e 380 HU. A eficiência da vacina foi avaliada através do ensaio de imunodifusäo dupla, ensaio imunoenzimático (ELISA) e por um desafio, em que a amostra de Escherichia coli virulenta foi inoculada nos bezerros nascidos de vacas vacinadas e näo vacinadas. Observamos que a vacina contendo 750 HU foi a que melhor induziu a produçäo de anticorpos nas vacas vacinadas, e que estes mostratam-se protetores, uma vez que os bezerros nascidos de vacas vacinadas e que mamaram o colostro, nada sofreram no desafio. Näo se verificou nenhum efeito colateral nas vacas vacinadas

Capacidade hemaglutinante de amostras de Pasteurella multocida isoladas de suínos e sua associaçäo com fímbria e dermotoxicidade / Haemagglutinating capability of Pasteurella multocida strains isolated from swine and their association with fimbriae and dermotoxicity

Estudaram-se 76 amostras de P. multocida (Pm), 70 isoladas das cavidades nasais de leitöes afetados com rinite atrófica e seis isoladas de pulmöes, provenientes de 16 propriedades no Sul do Brasil. Amostras de Pm do tipo D e toxigênicas foram isoladas em 10 das 16 propriedades. O tipo capsular D foi prevalente na cavidade nasal (77 por cento das amostras), enquanto que nos pulmöes prevaleceu o tipo A (83 por cento). Todas as amostras toxigênicas isoladas de cavidade nasal (55 por cento) pertenciam ao tipo D e uma, isolada do pulmäo, ao tipo A. Nove padröes de hemaglutinaçäo (HA) foram identificados com as hemácias de suíno, coelho, cobaio, ovelha e galinha. Cinquenta e nove por cento das amostras toxigênicas e do tipo D aglutinavam todas as hemácias citadas (padräo I). O meio de Minca com 10 por cento de soro bovino propiciou os títulos HA mais elevados. Näo se detectou efeito da temperatura de cultivo nos títulos de HA e näo se observou associaçäo entre HA, dermotoxicidade e fimbria

Reproduçäo experimental da rinite atrófica com Pasteurella multocida em leitöes tratados com ácido acético ou inoculados com Bordetella bronchiseptica / Experimental reproduction of atrophic rhinitis with Pasteurella multocida in piglets treated with acetic acid or inoculated with Bordetella bronchiseptica

Avaliou-se a capacidade de diferentes amostras de P. multocida toxigênicas do tipo D, após tratamento da mucosa nasal com ácido acético, em colonizar a cavidade nasal e induzir rinite atrófica (RA) em leitöes, associadas ou näo com B. bronchiseptica. P. multocida foi reisolada mais frequentemente da cavidade nasal dos animais inoculados com B. bronchiseptica do que daqueles tratados com ácido acético. Duas amostras de P. multocida (4735 e 4776) induziram RA grave somente nos leitöes tratados com ácido acético ou inoculados previamente com B. bronchiseptica toxigênica em fase I. A amostra 3497 de P. multocida somente induziu RA grave nos leitöes tratados com ácido acético e quando associada a amostra 4963 de B. bronchiseptica em fase I e toxigênica, sendo reisolada em maior número e com maior frequência das cavidades nasais que as demais amostras de B. bronchiseptica. Existem diferenças entre amostras toxigênicas de P. multocida quanto à capacidade de colonizar a cavidade nasal e induzir RA grave em leitöes

Associaçäo de Pasteurella multocida toxigênica do tipo D ao trato respiratório superior dos suínos / Association of toxigenic type D Pasteurella multocida to the upper respiratory tract of swine

Objetivou-se determinar se associaçäo poderia ser o mecanismo pelo qual P. multocida integra-se com a mucosa nasal dos leitöes. Cortes criostáticos de anéis de traquéias inoculadas com amostra toxigênica de P. multocida do tipo D e de secçöes de tecido amigdalino, fixados em formalina e embebidos em parafina, de leitöes SPF de cinco a oito semanas de idade, inoculados como amostra toxigênica de P. multocida, foram submetidos às técnicas de imunoperoxidase (IP) para detectar P. multocida. Os números de Bordetella bronchiseptica e P. multocida nas secreçöes nasais e amígdalas, de 85 leitöes, foram estimados à necropsia. Os leitöes foram inoculados com amostra toxigênica de P. multocida do tipo D, após terem sido inoculados com B. bronchiseptica ou após terem suas cavidades nasais tratados por ácido acético. P. multocida foi recuperada das amígdalas de 47 (72 por cento) e das secreçöes nasais de 13 (20 por cento) animais inoculados, sendo o número de bactérias recuperado das amígdalas superior (P<0,005) ao das secreçöes nasais. Maior número de B. bronchiseptica foi isolado das secreçöes nasais. P. multocida associou-se ao muco presente no lúmen dos anéis e aderiu pobremente às células mucosas, e foi encontrada dentro das criptas das amígdalas sem invadir o parênquima glandular e sem aderir ao epitélio

Ocorrência de fímbria em amostras toxigênicas de Pasteurella multocida do tipo D isoladas de suínos e tentativas de estabilizar sua expressäo / Occurrence of fimbriae in toxin-producing type D Pasteurella multocida isolated from pigs and attempts to stabilize its expression

Pesquisou-se em amostras toxigênicas de P. multocida (tipo D) a presença de fímbrias e analisaram-se algumas possíveis condiçöes para sua expressäo com o intuito de caracterizar esta estrutura como uma possível adesina. Amostras de P. multocida com certos títulos hemaglutinantes elevados, com poucas passagens em meios de cultivos após isolamento de animais inoculados, formaçäo de películas em meios líquidos e variaçöes fenotípicas introduzidas por alfa, alfa, dypiridil (DIB) foram cultivadas em agar sangue (AS), caldo BHI, Minca suplementado com 10 por cento de soro bovino, com e sem agar, caldo de infusäo de conchas nasais e pulmöes, meio de Heddlestone, meio básico com hemina (0,5 a 30 ug/ml) e em AS com 70uM de DIB. Fímbrias foram observadas, à microscopia eletrônica, de forma instável e somente em amostras recém isoladas de suínos, cultivadas em AS. Näo houve aumento da produçäo de fímbria quando as bactérias foram cultivadas nas demais condiçöes testadas

Capacidade adesiva de amostras toxigênicas de Pasteurella multocida do tipo D em células HeLa, HEp-2 e de conchas nasais de suínos / Adhesive capability of toxigenic type D Pasteurella multocida strains in HeLa, HEp-2 and pig nasal turbinate cells

Três amostras toxigênicas de Pasteurella multocida foram submetidas a testes de aderência "in vitro", utilizando-se linhagens de células HeLa, HEp-2 e preparados de células de conchas nasais de suínos (CCNS). Para o teste de adesäo em CCNS, as amostras foram cultivadas em caldo infuso de cérebro e coraçäo, Agar Sangue (AS), meio de Minca com soro bovino e no meio de Heddlestone, com e sem alfa, alfa, dypiridil. Amostras de P. multocida (tipo D) näo aderiram em cultivos de células HeLa e HEp-2. Nos testes de aderência de P. multocida com CCNS, verificou-se que 80 por cento das células ciliadas continham menos do que três bactérias aderidas aos cílios ou ao corpo celular. Entre as células näo ciliadas, este número foi de 5 por cento. As amostras de Pasteurella multocida näo diferiram entre si e nem com relaçäo à E. coli-K12 (controle negativo) na capacidade adesiva. Pelos testes realizados "in vitro", concluiu-se que Pasteurella multocida possui pouca afinidade para as células testadas nas condiçöes discriminadas

Gangliosides inhibit serological reactions for the detectionn of cholera and heat-labile enterotoxins of cholera and heat-labile enterotoxins of Escherichia coli

GM1 ganglioside has been identified as the receptor for cholera toxin (CT) and heat-labile (LT) enterotoxin of Escherichia coli in many cell types. Using the radial immune hemolysis (RIH) and indirect hemagglutination (IH) tests described for the detection of these enterotoxins, a study was conducted on the 100% inhibition of these reactions by pre-incubating these enterotoxins, a study was conducted on the 100% inhibition of these reactions by pre-incubating these enterotoxins with GM1, GD 1a and GT1 gangliosides. GM1 was found to be much more efficient than the othjer two. With respect to the RIH test, GT1 was more efficient than GD1a as an inhibitor of enterotoxin binding. Similar results were obtained with the IH test. These data also showed that sheep red blood cells provide a good model system for the study of receptors for CT, LT and probably other enterotoxins which bind to gangliosides