Preparación, radiomarcaje con 99mTc y 67Ga y estudios de biodistribución de nanopartículas de albúmina con recubrimientos poliméricos / Preparation, radiolabeling with 99mTc and 67Ga and biodistribution studies of albumin nanoparticles covered with polymers

OBJETIVO: Optimizar el radiomarcaje con 99mTc y 67Ga de nanopartículas de albúmina recubiertas con 4 polímeros sintéticos distintos y evaluar su estabilidad in vivo e in vitro, así como su biodistribución in vivo tras su administración intravenosa. MATERIAL Y MÉTODOS: Las nanopartículas se prepararon empleando albúmina y albúmina modificada con NOTA mediante el método de desolvatación y se recubrieron con 4 polímeros distintos; HPMC, GMN2, GPM2 y GTM2. Se purificaron, liofilizaron y caracterizaron. El marcaje con 99mTc se realizó con 74MBq de pertecnetato [99mTc] sódico previamente reducido con una disolución ácida de cloruro de estaño a diferentes concentraciones (0,003; 0,005; 0,007; 0,01; 0,05 y 0,1mg/ml), a distintos tiempos (5, 10, 15, 30 y 60min) y temperaturas (temperatura ambiente, 40°C y 60°C). El marcaje con 67Ga se llevó a cabo mediante incubación de las nanopartículas con 37MBq de cloruro de 67Ga (obtenido a partir de citrato de 67Ga comercial) a distintos tiempos (10 y 30min) y temperaturas (temperatura ambiente, 30°C y 60°C) y posterior purificación con microconcentradores. La pureza radioquímica de ambos marcajes se evaluó mediante TLC. Se llevaron a cabo estudios de estabilidad de las nanopartículas marcadas en suero fisiológico y plasma sanguíneo. Los estudios de biodistribución de las nanopartículas recubiertas con el polímero GPM2 se llevaron a cabo en ratas Wistar tras la administración intravenosa de las nanopartículas. Se realizaron animales control con pertecnetato [99mTc] sódico y cloruro de 67Ga. Posteriormente, los animales fueron sacrificados y se midió la actividad de los órganos en un contador gamma. RESULTADOS: El marcaje con 99mTc se llevó a cabo de forma óptima con una concentración de estaño de 0,007mg/ml para las nanopartículas GPM2 y de 0,005mg/ml para el resto de formulaciones, con un tiempo de marcaje de 10min y a temperatura ambiente. En el caso del 67Ga el marcaje se optimizó a 30°C de temperatura y 30min de incubación. En ambos casos, la pureza radioquímica obtenida fue superior al 97%. Las nanopartículas presentaron una elevada estabilidad in vitro pasadas las 48h del marcaje (70% las nanopartículas marcadas con 99mTc y 90% las marcadas con 67Ga). Los estudios de biodistribución de las nanopartículas [99mTc]-GPM2 y [67Ga]-NOTA-GPM2 mostraron una elevada acumulación de actividad en el hígado tanto a las 2h como a las 24h de la administración intravenosa. CONCLUSIÓN: El procedimiento de marcaje con 99mTc y 67Ga de nanopartículas de albúmina y albúmina modificada con NOTA permite la obtención de nanopartículas con elevados rendimientos de marcaje y una adecuada estabilidad in vitro, permitiendo su utilización para la realización de estudios in vivo

OBJECTIVE: To optimize radiolabeling with 99mTc and 67Ga of albumin nanoparticles coated with 4 differents synthetic polymers and to evaluate their stability in vivo and in vitro, as well as their biodistribution in vivo after intravenous administration. MATERIAL AND METHODS: The nanoparticles were prepared using albumin and NOTA-modified albumin by the desolvation method and coated with 4 different polymers; HPMC, GMN2, GPM2 and GTM2. They were purified, lyophilized and characterized. Radiolabelling with 99mTc was perfomed with 74 MBq of 99mTc sodium pertechnetate, previously reduced with and acid solution of tin chloride at different concentrations (0.003, 0.005, 0.007, 0.01, 0.05 and 0.1mg/ml) and at different times (5, 10, 15, 30 and 60minutes) and temperatures (room temperature, 40°C and 60°C). Radiolabelling with 67Ga was perfomed by incubation of the nanoparticles with 37 MBq of 67Gallium chloride (obtained from commercial gallium-67 citrate) at different times (10 and 30minutes) and temperatures (room temperature, 30°C and 60°C), and posterior purification with microconcentrators. The radiochemical purity was evaluated by TLC. Stability studies of radiolabeled nanoparticles in physiological serum and blood plasma were perfomed. Biodistribution studies of nanoparticles coated with GPM2 polymer were carried out in Wistar rats after intravenous administration of the nanoparticles. Control animals were carried out with 99mTc sodium pertechnetate and 67Ga chloride. To do so, the animals were killed and activity in organs was measured in a gamma counter. RESULTS: 99mTc labeling was carried out optimally with a tin concentration of 0.007mg/ ml for the GPM2 nanoparticles and 0.005mg / ml for the rest of the formulations, with a radiolabelling time of 10minutes at room temperature. In the case of 67Ga the label was optimized at 30° C temperature and 30minutes of incubation. In both cases the radiochemical purity obtained was greater than 97%. The nanoparticles showed high stability in vitro after 48hours of labeling (70% nanoparticles labeled with 99mTc and 90% those labeled with 67Ga). Biodistribution studies of nanoparticles 99mTc -GPM2 and 67Ga -NOTA-GPM2 showed a high accumulation of activity in the liver at 2 and 24hours after intravenous administration. CONCLUSION: The labeling procedure with 99mTc and 67Ga of albumin and albumin modified with NOTA nanoparticles allows obtaining nanoparticles with high labeling yields and adequate in vitro stability, allowing their use for in vivo studies

Radiomarcaje y estudios de biodistribución de nanopartículas poliméricas como adyuvantes para la vacunación oftálmica frente a la brucelosis / Radiolabeling and biodistribution studies of polymeric nanoparticles as adjuvants for ocular vaccination against brucellosis

Objetivo. Optimizar el radiomarcaje con 99mTc de nanopartículas de Gantrez® manosiladas y cargadas con el antígeno de Brucella ovis (Man-NP-HS) y llevar a cabo estudios de biodistribución en un ratón tras la administración de las nanopartículas por vía ocular. Material y métodos. Las Man-NP-HS se obtuvieron por el método de desplazamiento del disolvente. Se purificaron, liofilizaron y caracterizaron. A continuación, se marcaron con 74MBq de 99mTcO4− previamente reducido con una disolución ácida de cloruro de estaño, trabajando en ausencia de oxígeno y con un pH final de 4. El rendimiento del marcaje se evaluó mediante TLC. Los estudios de biodistribución se llevaron a cabo en ratones tras la administración oftálmica de la formulación y de un control de 99mTcO4− libre. Para ello, se sacrificaron los animales a las 2 y a las 24h tras la administración ocular y se contaron los órganos en un contador gamma. Resultados. Se obtuvo un rendimiento de marcaje superior al 90%. Los estudios de biodistribución de 99mTc-Man-NP-HS permitieron detectar la actividad concentrada en la mucosa nasal y ocular y el tracto gastrointestinal tanto a las 2 como a las 24h frente a la biodistribución de 99mTcO4− libre que permaneció concentrado en la piel alrededor del ojo y en el tracto gastrointestinal. Conclusión. Los estudios de biodistribución de 99mTc-Man-NP-HS tras la administración oftálmica han permitido demostrar su biodistribución en las mucosas y el tracto gastrointestinal, característica indispensable como sistema de liberación de antígenos a través de la mucosa ocular. Esto, junto con su elevada respuesta inmune, efectiva protección y no virulencia, convierte a estas nanopartículas en una vacuna ideal antibrucelosis (AU)

Purpose. To optimize radiolabeling with 99mTc of mannosylated Gantrez® nanoparticles loaded with the Brucella Ovis antigen (Man-NP-HS) and to carry out biodistribution studies in mice after ocular administration of the nanoparticles. Material and methods. Man-NP-HS nanoparticles were prepared by the solvent displacement method. They were purified, lyophilized and characterized. Following this, they were radiolabeled with 74 MBq of 99mTcO4− previously reduced with an acidic stannous chloride solution, working in absence of oxygen and at a final pH of 4. Radiolabeling yield was evaluated by TLC. Biodistribution studies were carried out in mice after ocular administration of the formulation and control of free 99mTcO4−. To do so, the animals were humanely killed at 2 and 24hours after the ocular administration and activity in organs was measured in a Gamma counter. Results. Radiolabeling yield obtained was greater than 90%. Biodistribution studies of 99mTc-Man-NP-HS showed radioactivity accumulated at 2 and 24hours in nasal and ocular mucosa and gastrointestinal tract, in contrast to biodistribution of free 99mTcO4− that remained concentrated in the skin around the eye and gastrointestinal tract. Conclusion. Biodistribution studies of 99mTc-Man-NP-HS after ocular instillation have made it possible to demonstrate its biodistribution in nasal mucosa and gastrointestinal tract. This characteristic is essential as an antigenic delivery system throughout the ocular mucosa. This, together with its elevated immune response, effective protection and intrinsic avirulence make them a suitable anti-Brucella vaccine candidate (AU)

Nuevas formas farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades alérgicas / New pharmaceutical dosage forms for allergy treatment

La inmunoterapia para el tratamiento de enfermedades alérgicas implica ciertas desventajas, que pueden ser reducidas si se emplean adyuvantes adecuados, que sean capaces de amplificar la respuesta inmune con un efecto alergénico mínimo. En ese contexto, las formas farmacéuticas más prometedoras para aumentar la eficacia y seguridad de la inmunoterapia, parecen ser las micro y nanopartículas, de polímeros biodegradables y liposomas. En esta revisión describimos estudios previos de nuestro grupo en los que empleamos como adyuvante nanopartículas Gantrez® AN y demostramos su capacidad de estimular el sistema inmune. Empleamos dos tipos de nanopartículas, con y sin lipopolisacárido de Brucella ovis como inmunomodulador en un modelo de ratón alérgico a L. perenne. Encontramos que los ratones sensiblizados a Phleum cuando recibían inmunoterapia con nanopartículas Lolium-Gantrez® estaban protegidos de la anafilaxia inducida por el alérgeno tanto en las tasas de mortalidad como en los niveles de MCP-1. Probamos asi mismo estas formulaciones por vía oral en un modelo animal sensibilizado a ovoalbúmina y comprobamos que les protegía también del shock anafiláctico(AU)

Specific immunotherapy involves certain drawbacks which could be minimized by the use of appropriate adjuvants, capable of amplifying the right immune response with minimal side effects. In this context, we review different types of immunotherapy vehicles and coadyuvants. We describe previous studies by our group in which we demonstrated the adjuvant capacity of Gantrez® AN nanoparticles, which can effectively enhance the immune response. We employed two types of nanoparticles (with and without LPS of Brucella ovis as immunomodulator) within capsulated ovoalbumin and Lollium perenne extract, tested on a model of mice sensitized to this allergenic mixture. In the challenge experiment involving the sensitized mice, differences in the mortality rate and in the MCP-1 levels were found between the treated groups and the control. Under the experimental conditions of this model of mice pre-sensitized to L. perenne, Gantrez®AN nanoparticles appeared to be a good strategy for immunotherapy. We finally tested these carriers administered by the oral route and found that they were able to protect a model of mice sensitized to ovalbum in from anaphylactic shock(AU)

Nanomedicina: nanopartículas con aplicaciones médicas / Nanomedicine: nanoparticles with medical applications

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Synthetic particulate antigen deliverysystems for vaccination

La encapsulación de un antígeno (proteína, péptido o DNA)en partículas sintéticas constituye un punto de partida razonable para el diseño de vacunas subcelulares efectivas. Al dotarlo de las dimensiones de una partícula, se favorece su visualización por células presentadoras de antígeno (APC), como las células dendríticas(DC). Utilizando distintos materiales y procedimientos de fabricación, la tecnología farmacéutica puede construir partículas con un amplio rango de tamaños y variadas propiedades de superficie. Es nuestro objetivo con esta revisión analizar cómo estas propiedades físicas afectan a la intensidad y al tipo de respuesta inmunitaria que producen. Así, partículas de distinto tamaño podrían poner en juego distintas APC y subtipos de DC. Susuperficie puede ser recubierta con ligandos que promueven la endocitosis receptor-específica y algún inmunoestimulante intrínsecoco-encapsulado junto con el antígeno dentro de la misma partícula. El mecanismo de captura antigénica y el tipo de señal de activación pueden ser decisivos para potenciar y modular la respuesta inmunitaria al tipo deseado, Th2/humoral o Th1/citotoxica. Adicionalmente, las partículas que son de naturaleza polimérica pueden liberar lentamente el antígeno encapsulado, de forma continua o pulsátil, evitando la necesidad de administraciones repetidas normalmente requerida para las vacunas tradicionales.Las partículas sintéticas para la encapsulación de antígenos constituyen por tanto, una buena herramienta que puede hacer posible el diseño de vacunas seguras y efectivas con una sola administración,algunos de los atributos de una vacuna ideal. Existen ciertos problemas tecnológicos, pero no parecen insalvables (AU)

Synthetic particles as carriers for antigens display a greatpotential and versatility for the design of effective vaccines. Supported by multiple raw materials and preparation procedures,they can be engineered over a wide range of sizes, variable surfacenature and patterns of antigen release. It is our goal in this review to evaluate how these physical characteristics decide the type of immune response the particles will develop, aiming at amore rational design of effective and safer synthetic subunit vaccines.So, as a function of their size, they will be uptaken by different antigen presenting cell (APC) or dendritic cell (DC) subsets;certain ligands can be attached to the particle surfaces to promotereceptor-specific endocitosis and any immunopotentiatorco-encapsulated with the antigen in the same particle. The mechanism of antigen uptake and the signal for activating DC can be decisive to increase and skew a Th1/cytotoxic or Th2/humoral response. Also, the antigen release rate has influence on the generation of immunological memory and an adequate profile of antigen release from these particles can mimic boosters of the traditionalvaccines.The current tendencies are oriented towards the development of new vaccines containing perfectly characterized antigens, establishedand safe, and with composition and preparation methods rigorously controlled. The use of synthetic particles as vectors may be considered as adjuvants that accomplish with these requisites, being able to induce a response even at the mucosal level.There are technological handicaps faced by developers of syntheticparticles based vaccines but do not appear to be insurmountable (AU)

Synthetic particulate antigen delivery systems for vaccination

La encapsulación de un antígeno (proteína, péptido o DNA)en partículas sintéticas constituye un punto de partida razonablepara el diseño de vacunas subcelulares efectivas. Al dotarlo delas dimensiones de una partícula, se favorece su visualización porcélulas presentadoras de antígeno (APC), como las células dendríticas(DC). Utilizando distintos materiales y procedimientosde fabricación, la tecnología farmacéutica puede construir partículascon un amplio rango de tamaños y variadas propiedadesde superficie. Es nuestro objetivo con esta revisión analizar cómoestas propiedades físicas afectan a la intensidad y al tipo de respuestainmunitaria que producen. Así, partículas de distinto tamañopodrían poner en juego distintas APC y subtipos de DC. Susuperficie puede ser recubierta con ligandos que promueven laendocitosis receptor-específica y algún inmunoestimulante intrínsecoco-encapsulado junto con el antígeno dentro de la mismapartícula. El mecanismo de captura antigénica y el tipo de señalde activación pueden ser decisivos para potenciar y modular larespuesta inmunitaria al tipo deseado, Th2/humoral o Th1/citotoxica.Adicionalmente, las partículas que son de naturaleza poliméricapueden liberar lentamente el antígeno encapsulado, deforma continua o pulsátil, evitando la necesidad de administracionesrepetidas normalmente requerida para las vacunas tradicionales.Las partículas sintéticas para la encapsulación de antígenosconstituyen por tanto, una buena herramienta que puede hacerposible el diseño de vacunas seguras y efectivas con una sola administración,algunos de los atributos de una vacuna ideal. Existenciertos problemas tecnológicos, pero no parecen insalvables

Synthetic particles as carriers for antigens display a greatpotential and versatility for the design of effective vaccines. Supportedby multiple raw materials and preparation procedures,they can be engineered over a wide range of sizes, variable surfacenature and patterns of antigen release. It is our goal in thisreview to evaluate how these physical characteristics decide thetype of immune response the particles will develop, aiming at amore rational design of effective and safer synthetic subunit vaccines.So, as a function of their size, they will be uptaken by differentantigen presenting cell (APC) or dendritic cell (DC) subsets;certain ligands can be attached to the particle surfaces to promotereceptor-specific endocitosis and any immunopotentiatorco-encapsulated with the antigen in the same particle. The mechanismof antigen uptake and the signal for activating DC can bedecisive to increase and skew a Th1/cytotoxic or Th2/humoralresponse. Also, the antigen release rate has influence on the generationof immunological memory and an adequate profile of antigenrelease from these particles can mimic boosters of the traditionalvaccines.The current tendencies are oriented towards the developmentof new vaccines containing perfectly characterized antigens, establishedand safe, and with composition and preparation methodsrigorously controlled. The use of synthetic particles as vectorsmay be considered as adjuvants that accomplish with these requisites,being able to induce a response even at the mucosal level.There are technological handicaps faced by developers of syntheticparticles based vaccines but do not appear to be insurmountable

Liberación controlada de principios activos mediante el empleo de formulaciones galénicas / Controlled liberation of active principles by means of new galenic formulations

Los principios activos incluidos en una forma galénica convencional se distribuyen indistintamente entre dianas biológicas específicas y otros tejidos anatómicos. Con el fin de obtener una terapéutica más racional y mejor adaptada, una de las posibilidades más prometedoras es la que utiliza el concepto de vectorización: asociación del principio activo a un vector apropiado, con objeto de aumentar la eficacia y la especificidad de acción del mismo. De esta manera, no solo aumenta la afinidad del fármaco por la diana, sino que además queda protegido de un ambiente potencialmente hostil (enzimas hidrolíticas, pH ácido, etc.). El éxito en la extensión de las aplicaciones de la vectorización depende cada vez más de un diseño adecuado, por lo que el objetivo fundamental de esta revisión será la de presentar las características generales y algunas de las actuales aplicaciones de estas nuevas formas farmacéuticas (AU)