Identification of causative Leishmania species in Giemsa-stained smears prepared from patients with cutaneous leishmaniasis in Peru using PCR-RFLP.

A PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) targeting the mannose phosphate isomerase gene was established to differentiate Leishmania species distributed near the Department of Huanuco, Peru. The technique was applied to 267 DNA samples extracted from Giemsa-stained smears of cutaneous lesions taken from patients suspected for cutaneous leishmaniasis in the area, and the present status of causative Leishmania species was identified. Of 114 PCR-amplified samples, 22, 19, 24 and 49 samples were identified to be infected by Leishmania (Viannia) braziliensis, L. (V.) peruviana, L. (V.) guyanensis, and a hybrid of L. (V.) braziliensis/L. (V.) peruviana, respectively, and the validity of PCR-RFLP was confirmed by sequence analysis. Since PCR-RFLP is simple and rapid, the technique will be a useful tool for the epidemiological study of leishmaniasis.

A rapid molecular diagnosis of cutaneous leishmaniasis by colorimetric malachite green-loop-mediated isothermal amplification (LAMP) combined with an FTA card as a direct sampling tool.

Leishmaniasis remains one of the world's most neglected diseases, and early detection of the infectious agent, especially in developing countries, will require a simple and rapid test. In this study, we established a quick, one-step, single-tube, highly sensitive loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid detection of Leishmania DNA from tissue materials spotted on an FTA card. An FTA-LAMP with pre-added malachite green was performed at 64°C for 60min using a heating block and/or water bath and DNA amplification was detected immediately after incubation. The LAMP assay had high detection sensitivity down to a level of 0.01 parasites per µl. The field- and clinic-applicability of the colorimetric FTA-LAMP assay was demonstrated with 122 clinical samples collected from patients suspected of having cutaneous leishmaniasis in Peru, from which 71 positives were detected. The LAMP assay in combination with an FTA card described here is rapid and sensitive, as well as simple to perform, and has great potential usefulness for diagnosis and surveillance of leishmaniasis in endemic areas.

DNA barcoding for identification of sand fly species (Diptera: Psychodidae) from leishmaniasis-endemic areas of Peru.

Phlebotomine sand flies are the only proven vectors of leishmaniases, a group of human and animal diseases. Accurate knowledge of sand fly species identification is essential in understanding the epidemiology of leishmaniasis and vector control in endemic areas. Classical identification of sand fly species based on morphological characteristics often remains difficult and requires taxonomic expertise. Here, we generated DNA barcodes of the cytochrome c oxidase subunit 1 (COI) gene using 159 adult specimens morphologically identified to be 19 species of sand flies, belonging to 6 subgenera/species groups circulating in Peru, including the vector species. Neighbor-joining (NJ) analysis based on Kimura 2-Parameter genetic distances formed non-overlapping clusters for all species. The levels of intraspecific genetic divergence ranged from 0 to 5.96%, whereas interspecific genetic divergence among different species ranged from 8.39 to 19.08%. The generated COI barcodes could discriminate between all the sand fly taxa. Besides its success in separating known species, we found that DNA barcoding is useful in revealing population differentiation and cryptic diversity, and thus promises to be a valuable tool for epidemiological studies of leishmaniasis.

Development of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid mass-screening of sand flies for Leishmania infection.

Entomological monitoring of Leishmania infection in leishmaniasis endemic areas offers epidemiologic advantages for predicting the risk and expansion of the disease, as well as evaluation of the effectiveness of control programs. In this study, we developed a highly sensitive loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for the mass screening of sand flies for Leishmania infection based on the 18S rRNA gene. The LAMP technique could detect 0.01 parasites, which was more sensitive than classical PCR. The method was robust and could amplify the target DNA within 1h from a crude sand fly template without DNA purification. Amplicon detection could be accomplished by the newly developed colorimetric malachite green (MG)--mediated naked eye visualization. Pre-addition of MG to the LAMP reaction solution did not inhibit amplification efficiency. The field applicability of the colorimetric MG-based LAMP assay was demonstrated with 397 field-caught samples from the endemic areas of Ecuador and eight positive sand flies were detected. The robustness, superior sensitivity, and ability to produce better visual discriminatory reaction products than existing LAMP fluorescence and turbidity assays indicated the field potential usefulness of this new method for surveillance and epidemiological studies of leishmaniasis in developing countries.

Genetic diversity of the mitochondrial cytochrome b gene in Lutzomyia spp., with special reference to Lutzomyia peruensis, a main vector of Leishmania (Viannia) peruviana in the Peruvian Andes.

The genetic divergence caused by genetic drift and/or selection is suggested to affect the vectorial capacity and insecticide susceptibility of sand flies, as well as other arthropods. In the present study, cytochrome b (cyt b) gene sequences were determined in 13 species circulating in Peru to establish a basis for analysis of the genetic structure, and the intraspecific genetic diversity was assessed in the Lutzomyia (Lu.) peruensis, a main vector species of Leishmania (Viannia) peruviana in Peruvian Andes. Analysis of intraspecific genetic diversity in the cyt b gene sequences from 36 Lu. peruensis identified 3 highly polymorphic sites in the middle region of the gene. Haplotype and gene network analyses were performed on the cyt b gene sequences of 130 Lu. peruensis in 9 Andean areas from 3 Departments (Ancash, Lima and La Libertad). The results showed that the populations of La Libertad were highly polymorphic and that their haplotypes were distinct from those of Ancash and Lima, where dominant haplotypes were observed, suggesting that a population bottleneck may have occurred in Ancash and Lima, but not in La Libertad. The present study indicated that the middle region of the cyt b gene is useful for the analysis of genetic structure in sand fly populations.

Genotyping of sand fly species in Peruvian Andes where leishmaniasis is endemic.

Genotyping of sand fly species circulating in Peru was established on the basis of PCR-restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) of the 18S ribosomal RNA (rRNA) gene. The sequences of 18S rRNA gene fragments from 12 Lutzomyia and 1 Warileya species were determined and their RFLP-patterns were analyzed. Consequently, RFLP analysis with the restriction enzyme AfaI and then HapII or KpnI, followed by XspI successfully differentiated them. Intraspecific genetic diversity affecting RFLP-patterns was not detected in the specimens collected from 24 areas of 8 departments. The genotyping was applied to the surveillance of sand flies collected from Andean areas where leishmaniasis is endemic, and its usability was verified. The present method promises to be a powerful tool for the classification and surveillance of sand flies circulating in Peru.

Detection and identification of Leishmania species within naturally infected sand flies in the andean areas of ecuador by a polymerase chain reaction.

The surveillance of prevalent Leishmania and sand fly species in endemic areas is important for prediction of the risk and expansion of leishmaniasis. In this study, we developed a polymerase chain reaction (PCR)-based method for detection of Leishmania minicircle DNA within individual sand flies. Using this method, we detected minicircle DNA in 6 (3.3%) of 183 sand flies, while 5 (3.5%) of 143 were positive for Leishmania promastigotes in the same areas by microscopic examination. The species were identified as Leishmania (Leishmania) mexicana by nucleotide sequencing of the cytochrome b gene. Additionally, all the Leishmania-positive sand flies were identified as Lutzomyia ayacuchensis by the restriction enzyme digestion of the PCR-amplified 18S ribosomal RNA gene fragments. Since this combined method is relatively easy and can process a large number of samples, it will be a powerful tool for the rapid identification of prevalent sand fly and Leishmania species as well as monitoring the infection rate in sand fly populations in endemic areas.

Identification of endotrypanum species from a sloth, a squirrel and Lutzomyia sandflies in ecuador by PCR amplification and sequencing of the mini-exon gene.

PCR amplification and nucleotide sequencing of the mini-exon gene revealed that four strains isolated from a sloth (Choloepus hoffmanni), a squirrel (Sciurus granatensis) and two sandflies (Lutzomyia hartmanni) in Ecuador were indistinguishable from Endotrypanum monterogeii. Another strain isolated from Lu. hartmanni showed the high sequence similarity to E. schaudinni. Since three of these strains have been previously identified as Leishmania (Viannia) equatorensis, the results demonstrate that L. (V.) equatorensis is genetically closely related to the genus Endotrypanum. The present study also indicates that Endotrypanum species are distributed in arboreal animals and sandflies in Ecuador, and that mini-exon gene amplification is useful for epidemiological studies of Leishmania and Endotrypanum in the New World.

Análisis del karyotipo de Leishmania (Viannia) panamensis aislada de pacientes con leishmaniasis cutánea de la costa del pacífico en el Ecuador

El cariotipo ADN de aislamientos de Leishmania de pacientes con la forma cutánea de la enfermedad procedente de 9 zonas endémicas de la costa del pacífico del Ecuador, fueron analizados por electroforesis en gel de campo pulsado. Todos los stocks aislados, incluyendo aquellos de una misma área endémica, presentaron un patrón de bandas de ADN cromosómico diferente. La variación de tamaño en las bandas de ADN cromosómico resultó evidentemente particular en los cromosomas entre 400 y 800 kb. Sin embargo, se observaron también bandas de ADN de aproximadamente 230, 350, 800 y 850 kb. Sin embargo, se observaron también bandas de ADN de aproximadamente 230, 350, 800 y 850 kb. Debido a que un cariotipo ADN semejante ha sido reportado...

Estudios preliminares sobre el diagnóstico de leishmaniasis cutánea utilizando muestras de biopsias de piel por reacción en cadena de polimerasa

Se estudiaron métodos de diagnóstico de leishmaniasis cutánea por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando parásitos vultivados y muestras de biopsias de piel del Ecuador. Se prepararon template ADNs por ebullición por 10 minutos en soluciones Chelex al 5 por ciento. Los parásitos Leishmania fueron detectados por PCR, utilizando primers designados desdel el minicírculo (13A y 13B)y gen mini-exon (S-1629 y S-1630. Los primers primero mencionados amplificaron productos no específicos en ADN humano, y la sensibilidad de la reacción fue baja. Los últimos nunca amplificaron productos específicos aún en templete humano y posibilitaron la identificación a nivel de subgénero. Cuando se aumentó la sensibilidad...

Estudio sobre el tratamiento oral de la leishmaniasis cutánea con un derivado de la artemisina, al artesunato (Plasmotrim) en el Ecuador

Nuestro trabajo anterior reveló que las drogas antimaláricas, mefloquina (mephaquin) y artesunato (plasmotrim), son eficaces para la terapia oral de pacientes con leishmaniasis cutánea. A fin de determinar si estas drogas tienen efectos similares o diferentes es necesario desarrollar investigaciones más detalladas, basadas en casos adicionales de tratamiento, especialmente con el artesunato. Con este propósito, tratamos a 15 pacientes con leishmaniasis cutánea con artesunato. En el tratamiento se utilizó la siguiente dosificación: 1) para adultos con 45-59 kg de peso, y niños con más de 45 kg y/o mayores de 12 años, 100 mg de Plasmotrim (media tableta) después del desayuno y merienda por 10 días; y 2) para adultos...

Observación clínica del tratamiento tópico para la leishmaniasis cutánea, durante 5 años en el Ecuador

Tratamos de evaluar el uso tópico de algunas drogas utilizadas en el Ecuador por 5 años. El número total de pacientes tratados con unguento y solución tópicos fue de 162, distribuidos en 82 varones y 80 mujeres. La edad media de los pacientes fue de 17.60 (+-1.87) años en total, 17.11 (+-1.87) en varones y 18.09 (+-1.47) en mujeres. Los pacientes jóvenes, con menos de 20 años de edad representaban más del 60 por ciento del total del tratamiento tópico empleado, como sigue a continuación: 1) excelente, 2)bueno, 3)aceptable, 4)sin respuesta. El tratamiento con solución de antimoniato de meglumina produjo respuesta excelente en 13 pacientes, buena en 5, aceptable en 6 y ninguna en 1 paciente. El índice efectivo de respuesta...

Efectos de la Mefloquina sobre la leishmaniasis visceral en ratones

Evaluamos el efecto de la administración oral de mefloquina sobre leishmaniasis visceral experimental en ratones inoculados con Leishmania (Leishmania) donovani. Los ratones que recibieron mefloquina oral a una dosis de 75 mg/kg por dos días antes de ser infectados, mostraron una reducción del 50 por ciento del número de parásitos en el hígado. Sin embargo, la administración de la misma dosis por dos días después de la infección no tuvo efecto terapéutico tal como la eliminación de parásitos en el hígado de los ratones infectados.

Similaridad karyotipo de aislamientos de Leishmania de pacientes, flebotominos, y un perro doméstico, identificando la cepa L mexicana como el agente causal de la leishmaniasis cutánea en los Andes ecuatorianos

Los karyotipos DNA de Leishmania, aislados en 3 comunidades diferentes de los Andes ecuatorianos fueron examinados por electroforesis en gel agarosa de campo pulsado. La similaridad en el karyotipo fue detectada en 12 aislamientos; 4 aislamientos humanos y uno canino, aislados en Paute, 4 aislamientos y 1 de flebotomino aislados en Huigra, y 2 aislamientos de flebotominos en Alausí. Las distancias horizontales entre Paute y Alausí, y entre Alausí y Huigra, son de alrededor de 80 km y 20 km respectivamente. El patrón de banda de el DNA cromosómico de estos aislamientos, se caracterizó por una cadena cromosómica ordenada, especialmente por la presencia de 4 cromosomas de bajo peso molecular de 220, 250 y 325 kilobases...

Anticuerpos monoclonales específicos de especies desarrollados contra Leishmania (Viannia) equatorensis

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales contra promastigotes de Leishmania (Viannia), que fue recientemente descrita como una nueva especie (Grimaldi et al., 1992) Ratones BALB/c fueron inmunizados con homogenados de L. (v) equatorensis (promastigotes) obtenidos de un cultivo in vitro de 10 días. La fusión de células esplénicas inmunizadas con células de mieloma P3-X63-Ag8,6.5.3 resultó en la producción de 6 anticuerpos monoclonales (AcMs) contra L. (v) equatorensis. Entre estos, 5, AcMs 9F4, 7H6, 3A7, 8C1 y 1G5 se revelaron como específicos contra L (v) equatorensis por medio de ELISA contra un panel cruzado de cepas de Leishmania. Estos AcMs constituirán, por tanto, un útil incremento para el panel de ancicuerpos...

Evaluación in vitro de la actividad anti-promastigote de Leishmania de lotes de Glucantime (antimoniato de meglumina)

La actividad inhibitoria del crecimiento de promastigotes de Leishmania fue evaluada con 3 diferentes lotes de producción de antimoniato de meglumina (Glucantime), que ha venido siendo usado para el tratamiento de la leishmaniasis en el Ecuador. Por lo menos dos veces se detectaron diferencias en la actividad anti-promastigote de los diferentes lotes de Glucantime. La concentración efectiva de la droga que inhibió la proliferación de los promastigotes en un 50 por ciento (CE50) varió con diferentes especies de Leishmania, y los valores de CE50 de los lotes más efectivos estuvieron en el rango de 20-38 mg/m1 de Glucantine o 5.7-10.8 mg/m1 de antimonio.

Estudios de la composición de la fauna flebotomínica y su actividad de picadura al hombra en área endémica de leishmaniasis del Ecuador

Los aspectos biológicos de varias especies antropofilicas de flebotominos fueron examinados en dos áreas endémicas de leishmaniasis. En el sitio de estudio I (350m-600m sobre el nivel del mar) localizado en la estribación andina, se examinaron cuidadosamente la densidad de población, actividad de picadura e índice de infección natural con promastoigotes de Leishmania, y los resultados obtenidos fueron comparados con los de 1983, y 1991/1993. Los datos revelaron que hubo una gran diferencia entre los dos sitios de estudio (1983 y 1991/1993). En el sitio de estudio II (400m s.n.m), localizado en la cordillera de la región costera del Pacífico, la composición de especies y la actividad de picadura fueron examinadas...

Investigación sobre la infección natural de flebotominos, Lutzomya spp., con Leishmania en un área endémica, km 101, Provincia de Manabí, Ecuador

Seis especies antropofílicas de Lutzomya, Lu. gomezi, Lu hartmanni, Lu serrana, Lu. trapidoi, Lu shannoni y Lu. panamensis, fueron examinadas en busca de su infección natural con promastigotes de Leishmania, en un área endémica de esta enfermedad, Km 101 (vía Manta-Quevedo), Provincia de Manabí. Un total de 2,530 ejemplares fueron disecados, pero no se encontró infección natural. En el texto, el ciclo de transmisión de leishmaniasis en el área fue brevemente discutido.

Paridad de Lutzomya spp., colectadas en diferentes áreas endémicas de leishmaniasis en Ecuador

Se examinó cuidadosamente el desarrollo folicular de los flebotominos capturados en las tierras bajas y altas del país. El índice de paridad de Lutzomya ayacuchensis fue 9.0 por ciento (10/111) en las colecciones nocturnas, y 9.2 por ciento (9/98) en las colecciones diurnas tempranas en las alturas (Huigra, provincia de Chimborazo). No se encontró diferencia entre los índices de los insectos capturados en dos momentos diferentes (noche y amanecer). Los índices de paridad de Lu. gomezi y Lu. serrana de las tierras bajas (Guayabales y San Sebastián, provincia de Manabí) fueron 14.6 por ciento (7/48) y 0.0 por ciento (0/7), respectivamente. Algunas de las Lu. gomezi colectadas mostraron los niveles de desarrollo II o III...

Evaluación de ELISA en el diagnóstico de leishmaniasis en el Ecuador

El presente estudio fue diseñado para evaluar ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) como método diagnóstico para la leishmaniasis cutánea en el Ecuador. Se obtuvieron 95 sueros de los habitantes con lesiones cutáneas, en 3 áreas endémicas, San Plácido, Calceta y Junín, en la provincia de Manabí. En base a las manifestaciones químicas, se los dividió en 4 grupos; 11 tenían úlceras leishmaniásicas activas, 13 tenían cicatrices leishmaniásicas sin registro de tratamiento, 27 tenían lesiones leishmaniásicas y habían sido tratados, después de 1991, por nosotros, y 44 fueron considerados como no leishmaniásicos. Los sueros de estos individuos fueron sometidos a ELISA. Los antígenos para ELISA fueron preparados...