RESUMEN
Microcystins are hepatotoxic heptapeptides produced by some cyanobacterial genera under determined physico-chemical conditions in the environment, which are responsible for the intoxication and death of animals and humans. The detection of microcystins in potable water or recreational water is not carried out routinely in the majority of Brazilian states. The protein phosphatase 1 (PP1) inhibition test is a simple, rapid and reproducible colorimetric method. The applicability of the PP1 inhibition test was tested using Microcystis aeruginosa (strain 1, UFRJ- toxin producer) grown under controlled light and temperature condition (12/12h light/dark using 30 muE.m².s-1 at 23ºC) in a bioreactor. The total concentrations of P (24, 6 and 4 muM) and Fe (4 and 1 muM) were varied in ASM-1medium and their effects on the growth rates and toxin production were analyzed. A standard curve of PP1 inhibition by microcystin-LR reached detection limit of 0.01 ng.mL-1. Under the highest concentrations of P (24 muM) and Fe (4 muM), the production of microcystin was detected throughout the growth experiment. The highest concentration of microcystin was observed at 6 muM P while at 1 muM Fe, PP1 inhibition was not detected. Samples from environmental blooms in water reservoirs used for human and animal consumption, from southeast Brazil (Belo Horizonte/MG), were tested and quantified for microcystin presence by the PP1 colorimetric test. The concentration of microcystin varied from undetectable to 100 ng.mL-1 in the environmental samples with Microcistis flos-aquae as the predominant cyanobacterial strain.
Microcistinas (MC) são heptapeptídeos de ação neuro e hepatotóxica produzidas por alguns gêneros de cianobactérias em determinadas condições físico-químicas do ambiente e são responsáveis pela morte e intoxicação de animais e humanos. A detecção de MC em água destinada ao consumo no Brasil ainda não é realizada na maioria dos estados brasileiros. O teste de inibição de proteína fosfatase tipo 1 (PP1) por MC é um método colorimétrico simples, rápido e de boa reprodutibilidade. Para testar a aplicação do teste PP1 foram realizados estudos de crescimento de cianobactérias em bioreator com meio ASM-1 dentro de condições controladas de crescimento (12/12h luz/escuro usando 30 miE.m².s-1 de intensidade luminosa e temperatura constante de 23C) utilizando Microcystis aeruginosa (estirpe 1., UFRJ- produtor de MC). Variaram-se as concentrações de fósforo (P) em 24, 6 e 4 miM e de ferro (Fe) em 4 e 1mM. Uma curva padrão de inibição de PP1 pela MC-LR foi construída, tendo como limite de detecção 0.01 ng.mL-1. Em meio normal de crescimento (24 miM P e 4 miM Fe) para Microcystis aeruginosa, a produção de MC foi detectada continuamente durante o crescimento da cultura. A maior concentração de MC foi observada na concentração de 6 miM P e não foi detectada na concentração de 1 miM Fe. Amostras de florações ambientais, da região sudeste do Brasil (Belo Horizonte/MG), coletadas em corpos d'água utilizados para abastecimento e consumo humano, foram testadas e quantificadas para a presença de microcistina pelo teste colorimétrico PP1. A concentração de microcistina variou entre quantidades não detectáveis pelo método até 100 ng.mL-1 em amostras de floração da espécie Microcistis flos-aquae.
RESUMEN
An in vitro system was developed to induce and identify Xylella fastidiosa proteins that were differentially expressed in the presence of callus-derived extracts from its host, the citrus cultivar Pêra. To optimize the induction, we first developed a single culture medium for the growth of both, host and bacteria. This medium, CPXPm7, which mimics the citrus xylem sap, showed that X. fastidiosa at 72 h post-incubation had 10(8) colony forming units mL-1, while Pêra cells had the highest fresh weight content (0.79 g). After testing various methods of co-cultivation of the bacteria and host callus grown in this single medium, the best induction procedure was to grow X. fastidiosa in a solid medium amended with an extract of Pêra callus grown in CPXPm7. Analysis, by two-dimensional electrophoresis, of the X. fastidiosa proteins (120 µg of total proteins) grown in the presence of Pêra callus extract revealed 414 differentially expressed protein spots when compared to the protein profile obtained in the absence of the extract. The system developed in this study improves the induction and analysis of differentially expressed proteins of X. fastidiosa, which may be involved in pathogenicity.
Estudos in vitro foram desenvolvidos para obter proteínas de Xylella fastidiosa expressas diferencialmente na presença de calos do hospedeiro, citros cultivar Pêra. Para otimizar a indução, desenvolveu-se um meio de cultura comum, o qual foi baseado na seiva do xilema de citros, para cultivar a bacteria e os calos de Pêra. Dados mostraram, após 72 h de cultivo neste meio, 10(8) unidades formadoras de colônias de X. fastidiosa por mL, e 0,79 g de peso seco de células de Pêra. Após testar diferentes métodos de co-cultivo da bactéria com calos de Pêra neste meio, observou-se que a melhor taxa de indução ocorreu quando X. fastidiosa foi cultivada em meio sólido enriquecido com um extrato derivado dos calos de Pêra. Análise em gel bidimensional (2DE) de X. fastidiosa (120 µg) cultivadas na presença do extrato revelou 414 proteínas expressas diferencialmente quando comparado com o perfil proteico obtido na ausência do extrato.