Development and Evaluation of a Duplex Lateral Flow Assay for the Detection and Differentiation between Rabbit Haemorrhagic Disease Virus Lagovirus europaeus/GI.1 and /GI.2.

Rabbit Haemorrhagic Disease Virus 2 (RHDV2, recently named Lagovirus europaeus/GI.2) was first reported in France in 2010 and has spread globally since then, replacing most of the circulating former RHDV (genotype GI.1) in many countries. The detection and differentiation of both genotypes is of crucial importance for the surveillance of the disease. In this article, a duplex lateral flow assay (LFA) for antigen detection is described and evaluated, providing the first description of a quick and easy-to-use test that allows for the simultaneous detection and differentiation of RHDV genotypes GI.1 and GI.2. A panel of GI.1- or GI.2-infected and non-infected rabbit liver samples and liver exudates (136 samples) was analysed, obtaining a total sensitivity of 94.4% and specificity of 100%. These data confirm that the developed duplex LFA can be used as a reliable diagnostic test for RHD surveillance, especially in farms and the field.

Development of a duplex rapid assay for immunoglobulins M and G to evaluate the parvoviral immune status of clinically healthy dogs.

A duplex rapid assay for detection of serum antibodies to canine parvovirus (CPV) was developed. Canine immunoglobulin (Ig)M or IgG were captured in immunotubes with anti-canine IgM or IgG and detected with parvovirus VP2 recombinant protein followed by an anti-VP2 monoclonal antibody. The assay was tested using a collection of sera from dogs that were vaccinated against CPV on arrival at an animal shelter in Madrid, Spain. Results were compared with those of 2 commercial enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) considered as reference techniques. A high correlation was found between the duplex rapid assay and the ELISAs, presenting an accuracy of 98% and 100% for IgG and IgM, respectively. According to the IgG and IgM levels at days 0-3 postvaccination, the samples were divided into 2 groups. One group of dogs showed high IgG and low IgM values at the first sampling post-vaccination and during the following 14 days, indicating that they had previously been in contact with the virus, either by vaccination or infection before arrival at the animal shelter. A second group of dogs appeared to be unvaccinated or uninfected before arrival at the animal shelter because they had negative IgM and IgG values soon after vaccination. These animals responded to vaccination, as demonstrated by seroconversion of both isotypes of immunoglobulins. The developed assay appears to be useful in determining the unknown immune status of dogs to CPV, especially in kennels and shelters where the rate of infection by CPV is relatively high.

Nitric oxide production by neutrophils obtained from patients during acute coronary syndromes: expression of the nitric oxide synthase isoforms.

OBJECTIVES: To analyze the differences in the nitric oxide (NO) forming system between neutrophils obtained from patients during unstable angina (UA) and during acute myocardial infarction (AMI). BACKGROUND: Neutrophils are involved in the regulation of thrombus formation through the release of active substances such as NO. Acute myocardial infarction is the result of an occlusive thrombus; unstable angina is attributed to intermittent thrombus formation. METHODS: We studied 49 patients admitted to hospital within 24 h after the onset of chest pain: 31 experienced AMI and 18 experienced UA. Acute myocardial infarction was defined as CK greater than two-fold the upper limit of normal value of biochemical laboratory, with CK-MB >10% total CK. Unstable angina was defined as transient ST segment changes without significant increases in CK and CK-MB. RESULTS: The amount of NO generated by neutrophils from AMI patients was significantly higher than that generated by neutrophils from UA patients. Neutrophils from UA and AMI patients showed low levels of endothelial-like NO synthase protein expression and a marked expression of the inducible NO synthase (iNOS) isoform. Although neutrophils from patients during acute coronary syndromes generated high amounts of NO, they did not demonstrate an increased ability to stimulate cyclic guanosine monophosphate (cGMP) synthesis in platelets. This lack of activity to release NO by neutrophils from patients during AMI was unrelated to a defect in the platelet cGMP-forming system; sodium nitroprusside, an exogenous NO donor, similarly increased cGMP levels in platelets from AMI patients and healthy donors. CONCLUSIONS: Neutrophils from patients during AMI and UA showed an increased production of NO and a marked expression of the iNOS isoform. However, NO released from these neutrophils showed a deficient functionality. These findings could have clinical implications because they show differences in thrombus growth in patients with UA versus patients with AMI.

Efecto del losartán sobre la activación de plaquetas humanas por tromboxano A2 / Effect of losartan on human platelets activation by thromboxane A2

Introducción y objetivo. Estudios previos han demostrado que el losartán, antagonista de los receptores de tipo AT-1 de la angiotensina II (Ang II) podría bloquear al receptor del tromboxano A2 (TXA2) en la pared vascular.El objetivo del trabajo fue estudiar el efecto del losartán sobre la activación de plaquetas humanas. Materiales y métodos. Las plaquetas fueron obtenidas de 15 voluntarios sanos con edades comprendidas entre los 26 y 40 años. La activación plaquetaria fue medida por cambios en la transmisión de luz del plasma rico en plaquetas estimuladas por un análogo sintético del TXA2, el U46619 (5 × 10-6 mol/l).Resultados. El U46619 estimuló la agregación de las plaquetas, siendo significativamente inhibida por el losartán de manera dosis dependiente. Sólo dosis altas del EXP 3174, el metabolito hepático principal del losartán, consiguieron inhibir la activación plaquetaria inducida por el U46619. Captopril, inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina, no fue efectivo en modificar la agregación plaquetaria inducida por el análogo del TXA2. A pesar de que las plaquetas expresan receptores de tipo AT-1 de la Ang II, la Ang II exógena no modificó la agregación plaquetaria inducida por U46619. La unión del U46619 a las plaquetas fue competitivamente inhibida por el losartán en forma dependiente de la dosis. Sin embargo, sólo dosis altas de EXP 3174 redujeron la unión del U46619. Captopril no modificó la unión del U46619 a las plaquetas. Conclusiones. Losartán disminuyó la agregación plaquetaria por un mecanismo dependiente de TXA2. El EXP 3174 demostró una menor potencia que losartán en reducir la activación plaquetaria por TXA2. El captopril y la Ang II exógena no tuvieron efecto sobre la activación de plaquetas humanas. Estos resultados sugieren que el losartán redujo la activación plaquetaria inducida por el TXA2 por un mecanismo independiente del bloqueo de los receptores de tipo AT-1 (AU)

Efecto del triflusal sobre la agregación y secreción de las plaquetas humanas: papel del óxido nítrico / Effect of Triflusal on Human Platelet Aggregation and Secretion: Role of Nitric Oxide

Introducción y objetivos. Recientes estudios in vitro realizados en nuestro laboratorio demostraron que el triflusal reduce la agregación plaquetaria mediante la estimulación de la producción de óxido nítrico (NO) por los neutrófilos. El objetivo de este trabajo fue evaluar si el tratamiento in vivo con triflusal también aumenta la capacidad de los neutrófilos de generar NO analizando el papel del NO liberado por los neutrófilos sobre la agregación y secreción plaquetaria. Métodos. El estudio se realizó en 12 voluntarios sanos de 32 ñ 6 años a los que se administró triflusal (600 mg/día) durante 5 días, extrayéndoles plaquetas y neutrófilos antes y después del tratamiento y midiéndoles su capacidad de producir NO, el porcentaje de agregación de sus plaquetas frente a ADP y la capacidad de liberar factor transformante del crecimiento (TGF- ). Resultados. Tras el tratamiento con triflusal se obtuvieron los siguientes resultados: a) aumento de la producción de NO en los neutrófilos; b) potenciación de la inhibición de la agregación plaquetaria en presencia de neutrófilos, efecto que se revertía al incubar los neutrófilos con un antagonista de L-arginina, L-NAME, y c) la presencia de neutrófilos redujo la liberación del TGF- por las plaquetas determinado como medida de secreción plaquetaria, por un mecanismo independiente del NO. Conclusiones. Nuestro estudio demuestra que el tratamiento con triflusal (600 mg/día/5 días) estimula la producción de NO por los neutrófilos. Tras el tratamiento con triflusal los neutrófilos inhiben la agregación y la secreción de las plaquetas. El efecto antiagregante plaquetario demostrado por los neutrófilos fue dependiente del NO, pero no así la inhibición de la desgranulación plaquetaria (AU)