RESUMEN
As infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) podem ser causadas por bactérias, vírus e fungos, sendo de extrema importância para o sistema de tratamento e pacientes. Com o alarmante avanço no surgimento de bactérias resistentes, tem havido uma preocupação crescente com as IRAS de origem bacteriana. Nesse sentido, várias pesquisas buscam alternativas para os fármacos antimicrobianos convencionais, sendo que os peptídeos antimicrobianos (AMPs), como a lunatina-1, aparecem como moléculas promissoras. No entanto, os AMPs geralmente apresentam rápida degradação proteolítica no trato gastrointestinal e meia-vida curta na corrente sanguínea, principais fatores limitantes para sua aplicação no tratamento de IRAS. Entre as estratégias empregadas para superar esses inconvenientes, a PEGuilação apresenta-se como alternativa eficaz que aumenta o tempo de circulação in vivo dos AMPs, resultando na melhora farmacocinética e, em alguns casos, também farmacodinâmica. A PEGuilação consiste na ligação covalente de cadeias de polietileno glicol (PEG) ao peptídeo, que pode ser efetuada por meio de uma reação aleatória ou sítio-específica. Neste trabalho, desenvolveu-se uma PEGuilação sítio-específica no N-terminal da lunatina-1 empregando-se mPEG-NHS de 2 kDa em tampão fosfato 100 mM, visando o aumento da solibilidade deste peptídeo, bem como para avaliar sua ação antimicrobiana. Com relação à reação de PEGuilação, avaliou-se a influência da razão molar PEG:peptídeo (10:1 ou 15:1) a pH 8,5. Foi obtido um rendimento de PEGuilação de 92%, através da análise por RP-HPLC quantitativo. Quanto à purificação da lunatina-1 PEGuilada, foi empregada a técnica semi-preparativa de RP-HPLC utilizando a coluna C18. A caracterização da lunatina-1 PEGuilada, incluindo determinação do grau de PEGuilação, foi realizada por MALDI-TOF Autoflex Speed (Bruker), mostrando que a molécula foi monoPEGuilada na região N-terminal. A atividade antimicrobiana de lunatina-1 livre e bioconjugada frente a diferentes cepas bacterianas, sendo duas Gram-negativas (ATCC 25922 de Escherichia coli e ATCC 9027 de Pseudomonas aeruginosa) e uma Gram-positiva (CECT 239 de Staphylococcus aureus), foi estudada por determinação da concentração inibitória mínima (CIM) em microplaca, sendo que foram obtidos valores de CIM de 86 e 140 µM para o peptídeo liver e PEGuilado, respetivamente. O potencial hemolítico também foi estudado, sendo que a forma PEGuilada mostrou significativa redução da atividade hemolítica em comparação à forma livre. Em suma, a PEGuilação da lunatina-1, aumenta a sua solubilidade e reduz a atividade hemolítica. Porém, para viabilizar esta estratégia a PEGuilação deve ser reversível, pois a conjugação ao polímero reduz atividade antimicrobiana
Health care-related infections (HAIs) caused by bacteria, viruses and fungi are extremely important for patients and health systems. With the alarming advance in the emergence of resistant bacteria, a growing concern with HAIs of bacterial origin is observed. In this sense, several studies investigate alternatives to conventional antimicrobial drugs and antimicrobial peptides (AMPs), such as lunatin-1, appear as promising molecules. However, AMPs generally show rapid proteolytic degradation in the gastrointestinal tract and short half-life in the bloodstream, the main limiting factors for their therapeutic application to treat HAIs. Among the strategies used to overcome these drawbacks, PEGylation presents itself as an effective alternative that increases the in vivo circulation time of AMPs, resulting in improved pharmacokinetics and, in some cases, also pharmacodynamics. PEGylation consists on the covalent attachment of polyethylene glycol (PEG) chains to the peptide, which can be carried out by means of a random or site-specific reaction. In this work, a site-specific PEGylation was developed at the N-terminus of lunatin-1 using 2 kDa mPEG-NHS to increase the solubility of this peptide, as well as to evaluate its antimicrobial activity. Regarding the PEGylation reaction, the influence of the molar ratio PEG: peptide (10: 1 or 15: 1) at pH 8.5 was evaluated and a PEGylation yield of 92% was obtained, based on quantitative RP-HPLC analysis. As for the purification of PEGylated lunatin-1, semi-preparative RP-HPLC was used. The characterization of PEGylated lunatin-1, including determination of the degree of PEGylation, was performed by MALDI-TOF Autoflex Speed (Bruker), showing that the peptide was monoPEGylated in the N-terminal region. The antimicrobial activity of free and bioconjugated lunatin-1 against different bacterial strains, two Gram-negative (ATCC 25922 from Escherichia coli and ATCC 9027 from Pseudomonas aeruginosa), and one Gram positive (CECT 239 from Staphylococcus aureus), was studied by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) in a microplate, resulting in MIC values of 86 and 140 µM for the free and PEGylated peptide, respectively. The hemolytic potential was also studied and the PEGylated form showed a significant reduction in hemolytic activity compared to the free form. In short, the PEGylation of lunatin-1 increases its solubility and reduces hemolytic activity. However, to make this strategy feasible, PEGylation must be reversible, since the conjugation to the polymer reduces antimicrobial activity