Una vacuna de vesículas de membrana externa de Vibrio cholerae es aún una promesa: Caracterización proteómica / Outer membrane vesicle vaccine from Vibrio cholerae is still a promise: Proteomic characterization

Las epidemias de cólera afectan a un gran número de países africanos, asiáticos y del Caribe. Los cambios climatológicos y las constantes migraciones hacen que esta enfermedad se extienda, por lo que resulta necesario disponer de vacunas protectoras. En el presente trabajo se caracterizó una nueva vacuna de vesículas de membrana externa (VMEs) obtenidas de Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor serotipo Ogawa cepa C7258, en el Instituto Finlay de vacunas (Cuba), a través de métodos proteómicos. Se identificaron 53 proteínas presentes en las VME (4 proteínas por banda electroforética) separadas por electroforesis unidimensional (1D) y digeridas con tripsina. Los fragmentos obtenidos fueron separados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada a espectrometría de masa, secuenciados e identificados mediante bases de datos de proteínas Swiss-Prot y TrEMBL. El patrón proteico obtenido presentó algunas de las proteínas (12 proteínas citoplasmáticas y 5 proteínas de membrana externa) sugeridas dentro del proteoma de buena calidad para candidatos vacunales. Se estudiaron las mejores condiciones para la separación de las proteínas a través de electroforesis bidimensional. Las VME evaluadas cuentan con una composición fundamentada en proteínas necesarias para garantizar una respuesta inmune que proteja contra Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor serotipo Ogawa.

Cholera epidemics affect a large number of African, Asian and Caribbean countries. The climate changes and the constant migrations cause this disease to spread, making it is necessary to obtain protective vaccines. In the present work, a new vaccine of outer membrane vesicles (OMV) from V. cholerae O1 El Tor biotype Ogawa serotype strain C7258 at Finlay Institute of vaccines (Cuba) was characterized by proteomic methods. A total of 53 proteins present in the OMV (approximate ratio of 4 proteins by electrophoresis band) were identified, separated by one dimension electrophoresis and digested by tripsin method. The fragments were separated by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to mass spectrometry, sequenced and identified, using Swiss-Prot and TrEMBL protein databases. The pattern showed some proteins (12 cytoplasmic proteins and 5 outer membrane proteins) suggested within the highest quality proteome for vaccine candidate. The best conditions for proteins separation by two dimension electrophoresis were studied. The OMV composition was based on proteins described to the immunity response and protection against V. cholerae O1 El Tor biotype Ogawa serotype.

As epidemias de cólera afetam um grande número de países africanos, asiáticos e caribenhos. As mudanças climáticas e as constantes migrações fazem com que esta doença se espalhe, portanto é necessário ter vacinas protectoras. No presente trabalho, uma nova vacina de vesículas de membrana externa (VMEs) obtidas de Vibrio cholerae 01 biotipo El Tor sorotipo Ogawa cepa C7258, no Instituto de Vacinas Finlay (Cuba), através de métodos proteômicos. Foram identificadas 53 proteínas presentes nas VME (4 proteínas por banda eletroforética) separadas por eletroforese unidimensional (1D) e digeridas com tripsina. Os fragmentos obtidos foram separados por cromatografia de alta resolução (HPLC) acoplada a espectrometria de massa, sequenciados e identificados usando bancos de dados de proteínas Swiss-Prot e TrEMBL. O padrão proteico obtido apresentou algumas das proteínas (12 proteínas citoplasmáticas e 5 proteínas de membrana externa) sugeridas dentro do proteoma de boa qualidade para candidatos vacinais. As melhores condições para a separação de proteínas através de eletroforese bidimensional foram estudadas. As VME avaliados possuem uma composição baseada em proteínas necessárias para garantir uma resposta imune que proteja contra Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor sorotipo Ogawa.

Evaluation of enteric-coated tablets as a whole cell inactivated vaccine candidate against Vibrio cholerae.

A vaccine candidate against cholera was developed in the form of oral tablets to avoid difficulties during application exhibited by current whole cell inactivated cholera vaccines. In this study, enteric-coated tablets were used to improve the protection of the active compound from gastric acidity. Tablets containing heat-killed whole cells of Vibrio cholerae strain C7258 as the active pharmaceutical compound was enteric-coated with the polymer Kollicoat(®) MAE-100P, which protected them efficiently from acidity when a disintegration test was carried out. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) anti-lipopolysaccharide (LPS) inhibition test and Western blot assay revealed the presence of V. cholerae antigens as LPS, mannose-sensitive haemagglutinin (MSHA) and outer membrane protein U (Omp U) in enteric-coated tablets. Immunogenicity studies (ELISA and vibriocidal test) carried out by intraduodenal administration in rabbits showed that the coating process of tablets did not affect the immunogenicity of V. cholerae-inactivated cells. In addition, no differences were observed in the immune response elicited by enteric-coated or uncoated tablets, particularly because the animal model and immunization route used did not allow discriminating between acid resistances of both tablets formulations in vivo. Clinical studies with volunteers will be required to elucidate this aspect, but the results suggest the possibility of using enteric-coated tablets as a final pharmaceutical product for a cholera vaccine.

Estandarización de ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) para la cuantificación de anticuerpos IgG inducidos por una vacuna de vesículas de membrana externa de los serogrupos A y W135 de Neisseria meningitidis / Standardization of immunoenzimatic assays (ELISA) for the quantitative determination of IgG antibodies elicited by an-outer-membrane-vesicle vaccine from Neisseria meningitidis serogroups A and W13

La enfermedad meningocócica es una afección invasiva, de amplia incidencia mundial, cuyo agente causal es la bacteria gramnegativa Neisseria meningitidis . Existen vacunas polisacarídicas sin conjugar o conjugadas, contra cuatro de los cinco serogrupos responsables del 95 por ciento de los casos en el mundo. Para el serogrupo B, cuyo polisacárido es pobremente inmunogénico, se han evaluado varios candidatos vacunales producidos a base de vesículas de membrana externa. La determinación de la actividad bactericida y la cuantificación de IgG por ELISA han sido los métodos más utilizados en la medición de la respuesta inmune generada por vacunas contra la meningitis meningocócica. El segundo de estos métodos es utilizado en el Instituto Finlay como ensayo de inmunogenicidad para la liberación de lotes de VA-MENGOC-BC®. Como parte de una colaboración con investigadores noruegos, se trabaja en la obtención de un candidato vacunal contra los serogrupos A y W135 , basado en vesículas de membrana externa. En el presente trabajo se describe la estandarización de un ELISA para ser utilizado en la evaluación de la respuesta inmune del candidato vacunal bivalente

Invasive meningococcal disease constitutes a worldwide health problem. Gram negative bacteria, Neisseria meningitidis is the causal agent of this disease. Plain or conjugated polysaccharide vaccines are available against four of five serogroups responsible of more than 95 percent of cases in the world. Because serogroup B polysaccharide is non immunogenic, some vaccine candidates, based on outer membrane proteins have been obtained and evaluated in clinical trials. Bactericidal activity determination and ELISA IgG have been used to evaluate immune response generated by antimeningococcal vaccines. The latter has been used, as potency test, to release VA-MENGOC-BC® vaccine lots, produced at Finlay Institute. As a result of the collaboration with Norwegian researchers, a vaccine candidate based on outer membrane proteins against serogroups A and W135, has been obtained and evaluated in animal models. The current work describes the standardization of an ELISA method to be used in the immune response evaluation of the bivalent vaccinal candidate(AU)

Lactancia materna y respuesta humoral contra vacunas de toxoidetetánico y diftérico en niños de 2 años / Breastfeeding and humoral immune response against tetanus and diphtheria toxoid in children of 2 years old

Teniendo en cuenta que el impacto de la lactancia materna sobre la respuesta a la vacunación es controversial, se evaluó la influencia de la lactancia materna sobre la respuesta humoral a las vacunas con toxoide tetánico y diftérico en niños de 2 años de edad que culminaron la etapa básica de inmunización del esquema de vacunación infantil. Se seleccionaron 44 niños que se diferenciaron en dos grupos de estudios, de acuerdo con el tiempo que fueron amamantados. Para la determinación de las concentraciones de antitoxina diftérica y tetánica se utilizaron ensayos inmunoenzimáticos en fase sólida (ELISA). Al aplicar el test de Student en los resultados obtenidos se constató que recibir la lactancia materna exclusiva por 6 meses o más determinó un incremento en las concentraciones de antitoxina diftérica, mientras que no se evidenciaron diferencias en cuanto a las concentraciones de antitoxina tetánica detectadas entre los niños lactados de manera exclusiva por 6 meses o más, con aquellos lactados por períodos inferiores.Palabras clave: Lactancia materna, vacunas, toxoide tetánico, toxoide diftérico(AU)

Since the impact of breastfeeding on the response to vaccination is controversial, we studied the effect ofbreastfeeding on humoral response to tetanus and diphtheria vaccination in two years old children who haveended the immunization basic stage of the vaccination schedule. Forty-four children were selected, they werethen divided into two study groups according to the time they were breastfeeding. Solid phase immunosorbentassays (ELISA) were used to determine concentrations of diphtheria and tetanus antitoxin. After applying theStudent test to results, it was proved that exclusive breastfeeding for six months or longer showed an increase inthe concentrations of diphtheria antitoxin, while there was no difference of tetanus antitoxin concentrationsdetected among children exclusively breastfed for six months or more, with those breastfed for lesser periods. Keywords: Breastfeeding, vaccines, tetanus toxoid, diphtheria toxoid(AU)

Evaluación de la respuesta de anticuerpos hacia antígenos de Pseudomonas aeruginosa / Evaluation of antibodies response to Pseudomonas aeruginosa antigens

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno extracelular que genera una respuesta de anticuerpos específicos con utilidad para el diagnóstico y vacunas. En el presente estudio nos propusimos evaluar en suero humano los niveles de anticuerpos contra antígenos relevantes de P aeruginosa. Realizamos la determinación de anticuerpos IgG contra tres exoenzimas, consideradas como factores de virulencia de mayor importancia en infecciones. Este resultado dio paso a la evaluación del reconocimiento de IgG e IgA hacia antígenos de la envoltura celular bacteriana por ELISA de células enteras. Todos los sueros evaluados mostraron títulos de IgG e IgA superiores a los individuos sanos, con excepción de dos muestras de pacientes que no mostraron alto título. Este ensayopermitió analizar el nivel de reconocimiento hacia los antígenos más expuestos de la bacteria que incluyen principalmente LPS y proteínas de membrana externa. Se encontró diferencias entre los valores de densidad óptica a 450 nm de individuos sanos y enfermos. El método usado permitió seleccionar dos sueros de pacientes de diferentes tipos de infecciones que fueron comparados por Western blot. Se observó que aunque los sueros tenían reacción hacia distintos serotipos de P aeruginosa, la intensidad del reconocimiento variaba según el tipo de infección(AU)

Reactogenicidad e inmunogenicidad de una nueva vacuna de toxoide tetánico y diftérico con concentración reducida en adolescentes cubanos / Reactogenicity and immunogenicity of a new tetanus toxoid and reduced diphtheria toxoid vaccine in

Se realizó un estudio aleatorizado, controlado y a doble ciegas en 225 adolescentes cubanos entre 13 y 16 años de edad, con el objetivo de evaluar la reactogenicidad y la inmunogenicidad de una nueva vacuna de toxoide tetánico y toxoide diftérico con concentración reducida, producida en el Instituto Finlay, con respecto a su similar comercial IMOVAX dT adult de Aventis Pasteur. Se tomaron muestras de suero antes y 21 días después de la vacunación. La reactogenicidad de ambas vacunas fue similar. Los síntomas y signos, tanto locales como generales fueron moderados y aparecieron principalmente durante las primeras 72 h después de la vacunación. Todos los voluntarios vacunados alcanzaron niveles protectores (³0,1 UI/mL) de antitoxina contra el tétanos y la difteria. El 99,25por ciento de los inmunizados con la vacuna experimental y el 98,36por ciento de los voluntarios del grupo control presentaron niveles de antitoxina tetánica correspondientes a una protección de larga duración (³1,0 UI/mL); para la antitoxina diftérica se alcanzaron estos niveles en el 81,20por ciento y 80,33por ciento de los voluntarios en cada grupo. Los títulos medios geométricos de antitoxina tetánica (21,73 UI/mL) y antitoxina diftérica (2,55 UI/mL) inducidos por la nueva vacuna fueron superiores (p<0,05) a los del grupo control: 15,55 UI/mL y 1,84 UI/Ml, respectivamente(AU)

Preparation and evaluation of vibrio cholerae O1 EL Tor Ogawa lipopolysaccharide-tetanus toxoid conjugates.

The lipopolysaccharide (LPS) of Vibrio cholerae is considered one of the most important antigens from the point of view of immunogenicity in these bacteria. We have undertaken detoxification of this LPS by basic hydrolysis and the resultant amine groups were used for their conjugation to tetanus toxoid as carrier protein using carbodiimide-mediated coupling. The resulting conjugates were inoculated in Balb/c mice for immunogenicity studies. The anti-LPS IgG and vibriocidal antibodies were measured in serum. The antigenicity of this conjugated was evaluated by ELISA, with serums of humans vaccinated with a strain genetically modified. The conjugated elicited: high titers of IgG anti-LPS, high titers of vibriocidal antibodies and there was recognition of LPS by antibodies from cholerae immunised human serum. These results show that the conjugated LPS obtained by us, could be evaluated like a potential vaccine for human use.

Obtención de extractos de membrana externa de Vibrio cholerae O1, mediante el uso de diferentes detergentes / Obtaining Vibrio cholerae 01 outer membrane extracts with different detergents

En la actualidad existen dos variantes principales de vacunas orales contra el cólera: una basada en células inactivadas de diferentes biotipos y serotipos y otra basada en la administración de cepas vivas genéticamente atenuadas. Una vacuna por subunidades pudiera ser una variante muy atractiva. Este trabajo describe la purificación parcial y caracterización preliminar de extractos de proteínas de membrana externa-lipopolisacárido (PME-LPS), obtenidos a partir de Vibrio cholerae O1, con el interés de seleccionar un proteoliposoma que posteriormente será estructurado en forma de cocleatos para su uso por vía oral en humanos. Las preparaciones fueron obtenidas a través del uso de diferentes detergentes. La cantidad de LPS en cada preparación fue estimada mediante la determinación de las unidades endotóxicas en el ensayo del Limulus (LAL). La composición de cada muestra fue evaluada mediante SDS-PAGE y Dot Blot. La inoculación intranasal (IN) en ratones Balb/c se utilizó para la evaluación de la inmunogenicidad de las preparaciones, y la respuesta inmune fue determinada por ELISA y el título de anticuerpos vibriocidas. El tamaño molecular de la preparación con mejores resultados en inmunogenicidad se estimó mediante la cromatografía en Sephacryl S-1000. Se obtuvieron diferentes perfiles electroforéticos de acuerdo con el tipo de detergente utilizado. El LPS fue identificado en todas las preparaciones y aquella obtenida con el SDS al 15(por ciento) mostró la más baja relación proteínas/LPS y los mejores resultados en los ensayos de inmunogenicidad. Adicionalmente se comprobó que su tamaño molecular es similar al observado en el proteoliposoma de VAMENGOC-BC. La preparación obtenida con el SDS al 15(por ciento) constituye un proteoliposoma, con capacidad para estimular altos nivelesde anticuerpos IgG anti-LPS y altos títulos de anticuerpos vibriocidas, luego de su administración por vía intranasal en ratones. Estos resultados constituyen un importante paso en las investigaciones dirigidas a la obtención de una vacuna por subunidades, como alternativa preventiva contra el cólera(AU)

Selección de cepas atenuadas de Vibrio cholerae para la obtención de candidatos vacunales atenuados orales contra el cólera / Selection of attenuated Vibrio cholerae strains to obtain oral attenuated candidate vaccines against cholera

Se desarrolló una metodología para la selección de cepas de Vibrio cholerae O1 y O139 modificadas genéticamente, con el objetivo de obtener candidatos vacunales atenuados orales contra el cólera. A las cepas modificadas se les realizó caracterización microbiológica, susceptibilidad bacteriana y diferentes pruebas biológicas (dosis letal media, capacidad colonizadora, adherencia en ratones, intestino ligado e inoculación intraduodenal en conejos como pruebas de virulencia y potencia). Las cepas 81, 638, 638T y 1333 fueron evaluadas en ensayos clínicos para determinar su reactogenicidad e inmunogenicidad. Todas las cepas fueron sensibles a la tetraciclina y doxiclicina y mostraron su atenuación e inmunogenicidad en modelos animales, resultando las cepas 638 y 1333 inmunogénicas y no reactogénicas en voluntarios

Selección de cepas atenuadas de Vibrio cholerae para la obtención de candidatos vacunales atenuados orales contra el cólera / Selection of attenuated Vibrio cholerae strains to obtain oral attenuated candidate vaccines against cholera

Se desarrolló una metodología para la selección de cepas de Vibrio cholerae O1 y O139 modificadas genéticamente, con el objetivo de obtener candidatos vacunales atenuados orales contra el cólera. A las cepas modificadas se les realizó caracterización microbiológica, susceptibilidad bacteriana y diferentes pruebas biológicas (dosis letal media, capacidad colonizadora, adherencia en ratones, intestino ligado e inoculación intraduodenal en conejos como pruebas de virulencia y potencia). Las cepas 81, 638, 638T y 1333 fueron evaluadas en ensayos clínicos para determinar su reactogenicidad e inmunogenicidad. Todas las cepas fueron sensibles a la tetraciclina y doxiclicina y mostraron su atenuación e inmunogenicidad en modelos animales, resultando las cepas 638 y 1333 inmunogénicas y no reactogénicas en voluntarios(AU)

The vaccine candidate Vibrio cholerae 638 is protective against cholera in healthy volunteers.

Vibrio cholerae 638 is a living candidate cholera vaccine strain attenuated by deletion of the CTXPhi prophage from C7258 (O1, El Tor Ogawa) and by insertion of the Clostridium thermocellum endoglucanase A gene into the hemagglutinin/protease coding sequence. This vaccine candidate was previously found to be well tolerated and immunogenic in volunteers. This article reports a randomized, double-blind, placebo-controlled trial conducted to test short-term protection conferred by 638 against subsequent V. cholerae infection and disease in volunteers in Cuba. A total of 45 subjects were enrolled and assigned to receive vaccine or placebo. The vaccine contained 10(9) CFU of freshly harvested 638 buffered with 1.3% NaHCO(3), while the placebo was buffer alone. After vaccine but not after placebo intake, 96% of volunteers had at least a fourfold increase in vibriocidal antibody titers, and 50% showed a doubling of at least the lipopolysaccharide-specific immunoglobulin A titers in serum. At 1 month after vaccination, five volunteers from the vaccine group and five from the placebo group underwent an exploratory challenge study with 10(9) CFU of DeltaCTXPhi attenuated mutant strain V. cholerae 81. Only two volunteers from the vaccine group shed strain 81 in their feces, but none of them experienced diarrhea; in the placebo group, all volunteers excreted the challenge strain, and three had reactogenic diarrhea. An additional 12 vaccinees and 9 placebo recipients underwent challenge with 7 x 10(5) CFU of virulent strain V. cholerae 3008 freshly harvested from a brain heart infusion agar plate and buffered with 1.3% NaHCO(3). Three volunteers (25%) from the vaccine group and all from the placebo group shed the challenge agent in their feces. None of the 12 vaccinees but 7 volunteers from the placebo group had diarrhea, and 2 of the latter exhibited severe cholera (>5,000 g of diarrheal stool). These results indicate that at 1 month after ingestion of a single oral dose (10(9) CFU) of strain 638, volunteers remained protected against cholera infection and disease provoked by the wild-type challenge agent V. cholerae 3008. We recommend that additional vaccine lots of 638 be prepared under good manufacturing practices for further evaluation.

[Selection of attenuated Vibrio cholerae strains to obtain oral attenuated candidate vaccines against cholera]. / Selección de cepas atenuadas de Vibrio cholerae para la obtención de candidatos vacunales atenuados orales contra el cólera.

A methodology was developed for the selection of genetically modified strains of Vibrio cholerae 01 and 0139 aimed at obtaining oral attenuated candidate vaccines against cholera. The modified strains underwent microbiological characterization, bacterial susceptibility and different biological tests (mean lethal dose, colonizing capacity, adherence in mice, ligated intestine and intraduodenal inoculation in rabbits as virulence and potency tests. The strains 81, 638, 638T and 1333 were evaluated in clinical trials to determine their reactogenicity and immunogenicity. All the strains were sensitive to tetracycline and doxoclycine. They showed their attenuation and immunogenicity in animal models. The strains 638 and 1333 proved to be immunogenic and non reactogenic in volunteers.

Determinación de las condiciones de ensayo óptimas en un / ELISA para la detección de anticuerpos séricos IgG anti-LPS / de Pseudomonas aeruginosa O11 / Determination of the optimal assay conditions for an ELISA to detect serum IgG antibodies of Pseudomonas aeruginosa O11

La selección de sueros de donantes sanos para la obtención de una gamma hiperinmune contra la infección por Pseudomona aeruginosa, así como la evaluación de la respuesta inmunológica de cualquier candidato vacunal contra este microorganismo necesita contar en el laboratorio con técnicas estandarizadas. En este trabajo se realizaron los ensayos necesarios para el montaje y laoptimización de un ELISA indirecto para la determinación de anticuerpos séricos de clase IgG anti-LPS de P. aeruginosa O11. Se evaluaron la concentración de recubrimiento, condiciones de bloqueo, dilución de trabajo de las muestras a evaluar y del conjugado con el fin de seleccionar en cada caso las mejores respuestas para el control positivo, el control negativo y el blanco del ensayo. Una concentración de 1,5 µg/mL de LPS O11 en PBS toda la noche a 4 °C como recubrimiento, lanecesidad de no incluir un paso adicional de bloqueo y el conjugado humano anti IgG-HRP diluido 1:3000, 1 h a 37 °C resultaron las variables óptimas para el ensayo. Por otra parte, se estableció el rango lineal de la curva del control positivo y se seleccionó la dilución de trabajo 1:100 para las muestras de sueros a evaluar(AU)

Pseudomonas aeruginosa: Vacunas: un reto a la investigación

Pseudomonas aeruginosa, patógeno gramnegativo versátil y oportunista debido a su gran adaptabilidad fisiológica, potencial metabólico y mecanismos de virulencia, es causa frecuente a escala mundial de severas o letales infecciones en pacientes hospitalizados. El empeño por lograr terapias alternativas para prevenir o combatir las infecciones producidas por P. aeruginosa ha ocupado a investigadores de todo el mundo desde la segunda mitad del pasado siglo y actualmente se continúan reportando trabajos que respaldan los ensayos de candidatos vacunales, fundamentalmente a partir de antígenos proteicos, mayoritariamente basados en la construcción de vacunas recombinantes. En este artículo se presenta una revisión de trabajos publicados sobre las investigaciones desarrolladas en diferentes países, con el objetivo de obtener candidatos vacunales para la prevención o tratamiento de las infecciones causadas por Pseudomonas aeruginosa, a partir de la década de los años 50 del siglo XX hasta el 2003(AU)

Validación del ensayo Vibriocida colorimétrico para / determinar anticuerpos séricos contra cepas candidatas / vacunales de Vibrio cholerae / Validation of Colorimetric Vibriocidal Assay to Determine Serum Antibodies against Vaccine Candidate Strains of Vibrio Cholerae

El Instituto Finlay posee un grupo de cepas atenuadas candidatas a vacuna oral contra el cólera, las cuales fueron evaluadas desde el punto de vista de su capacidad inmunogénica mediante la determinación de anticuerpos por el método ELISA y principalmente por el ensayo Vibriocida. Este ensayo mide la funcionalidad de los anticuerpos estimulados por la cepa vacunal, por lo que se considera la herramienta más eficaz para medir el estado de la inmunidad en individuos vacunados contra el cólera y constituye el soporte analítico para el desarrollo de la vacuna anticolérica cubana. En este trabajo se evaluaron la precisión, la especificidad y la robustez del ensayo y los resultados obtenidos estuvieron dentro del criterio de aceptación de esta técnica (>50(por ciento) de coincidencia). Se demostró que las variaciones entre las muestras negativas y positivas se debían precisamente al crecimiento de V. cholerae y que se pueden incorporar pequeños cambios al ensayo sin que esto traiga consigo variaciones en el título de la muestra ni falsos resultados. De acuerdo con los resultados obtenidos, el mismo se considera apto para la evaluación de la respuesta inmune estimulada por un candidato vacunal contra el cólera(AU)

Validación de un ensayo ELISA para la determinación de / anticuerpos anti LPS de Vibrio Cholerae / Validation of an ELISA assay to determine antibodies against LPS of Vibrio Cholerae

Para evaluar la respuesta inmunológica de cualquier candidato vacunal es necesario contar en el laboratorio con técnicas estandarizadas y validadas. Es por ello que en este trabajo se realizaron los ensayos para la estandarización del ELISA indirecto, usado para la determinación de anticuerpos séricos anti-LPS Ogawa contra cólera en suero de humanos inoculados por vía oral, así como la evaluación de los parámetros de validación típicos de este ensayo. Para la selección de las condiciones óptimas se evaluaron la concentración de recubrimiento, condiciones de bloqueo y dilución de conjugado, con el objetivo de seleccionar las mejores respuestas para el control positivo, el control negativo y el blanco en cada caso. Una concentración de 25 µg/mL de LPS Ogawa en PBS, como recubrimiento, durante toda la noche; leche descremada al 0,5(por ciento) en PBS, 30 min a temperatura ambiente como bloqueo y el conjugado anti-IgA-HRP diluido 1:5000, resultaron las variables óptimas para el ensayo. En cuanto a la validación de la técnica los parámetros evaluados fueron precisión, exactitud, límite de detección, especificidad y robustez. Para ello se siguió un protocolo de validación que permitiera evaluarlos, y en todos los casos el ensayo se consideró adecuado, siempre y cuando el coeficiente de variación resultara ser menor del 20(por ciento). En todos los parámetros evaluados se cumplió con este requisito, considerando así los resultados confiables y reproducibles(AU)

Construction and characterisation of O139 cholera vaccine candidates.

The hemagglutinin/protease (HA/P) seems to be an attractive locus for the insertion of heterologous tags in live cholera vaccine strains. A deltaCTXphi spontaneous mutant derived from a pathogenic strain of O139 Vibrio cholerae was sequentially manipulated to obtain hapA Colon, two colons celA derivatives which were later improved in their environmental safety by means of a thyA mutation. All the strains here obtained showed similar phenotypes in traits known to be remarkable for live cholera vaccines irrespective of their motility phenotypes, although the hapA mutants had a 10-fold decrease in their colonisation capacity compared with their parental strains in the infant mouse cholera model. However, the subsequent thyA mutation did not affect their colonisation properties in the same model. These preliminary results pave the way for further clinical assays to confirm the possibilities of these vaccine prototypes as safe and effective tools for the prevention of O139 cholera.

Inhibición del efecto anticolonizante del suero positivo de humanos inoculados con la cepa atenuada 638, vidrio cholerae 01 / Inhibition of anti-colonizing effect of positive serum from humans inoculated with the attenuated strain

Como parte de los estudios hacia la obtención de una vacuna contra el cólera, se evaluó la capacidad anticolonizante del suero de humanos despúes de la inoculación por vía oral de una dosis de la cepa atenuada 638 y se realizarón estudios de inhibición. Se utilizaron antígenos de la superficie externa de vidrio cholerae 01 tales como los lipopolisacáridos Ogawa, inaba y del serogrupo 0139, proteínas de membrana externa (PME) y el complejo antigénico de 20 kD. Se utilizó el modelo del ratón neonato. El suero positivo mostró una elevada actividad anticolonizante. En los estudios de inhibición por antígenos, se observó que el lipopolisacárido Owaga disminuyón significativamente la capacidad anticolonizante del suero positivo(AU)

[Helicobacter pylori CagA antibodies in various gastroduodenal diseases from 2 different populations]. / Anticuerpos frente a la citotoxina CagA de Helicobacter pylori en diversas enfermedades gastroduodenales en dos poblaciones diferentes.

BACKGROUND: We aimed at studying the prevalence of infection by H. pylori along with the CagA status of the strain in two populations (Spain and Cuba) and the relationship with several gastroduodenal lesions. We also studied the role of the test-and-scope strategy in the decrease of unnecessary gastroscopies. PATIENTS AND METHOD: 100 dyspeptic patients from Spain and 100 from Cuba were included. At endoscopy, antrum biopsies were obtained and H. pylori status was evaluated by rapid urease test. CagA status of the strain was assessed by Western Blot. The test-and-scope strategy was evaluated according to H. pylori infection and CagA status. RESULTS: Mean age of Spanish and Cuban patients was 45 (16) and 46 (15) years, respectively. Dyspeptic symptoms were similar in both groups. Prevalence of infection by H. pylori was higher in Cuban (73%) than in Spaniards (40%) (p < 0.01). Prevalence of CagA+ strains was also higher in Cuban (81 vs. 27%) (p < 0.01). Among CagA+ Spanish patients, 11% had a duodenal ulcer, whereas this lesion was not found in any CagA patient (p < 0.05). Duodenal ulcer prevalence in CagA+ and CagA Cuban patients was 31 and 0%, respectively (p < 0.05). The test-and-scope strategy would have avoided endoscopy in only 24% Spanish and 15% Cuban patients. CONCLUSIONS: The prevalence of H. pylori infection is higher in Cuban than in Spanish dyspeptic patients. H. pylori strains of Cuba seem to be more virulent than those of Spain. CagA protein is a marker of peptic ulcer in both populations. These differences could partly explain the variations in the prevalence of different gastroduodenal disorders between both countries. The test-and-scope strategy appears to avoid a low number of endoscopies.

Anticuerpos frente a la citotoxina cagA de helicobacter pylori en diversas enfermedades gastroduodenales en dos poblaciones diferentes / Helicobacter pylori CagA positive strains in gastroduodenal diseases from two different populations

FUNDAMENTO: Estudiar la prevalencia de la infección por Helicobacter pylori y el fenotipo CagA de la cepa en dos poblaciones (España y Cuba), y su relación con diversas lesiones gastroduodenales, así como el papel de la estrategia 'testar y realizar endoscopia' en la disminución del número de gastroscopias. PACIENTES Y MÉTODO: Se incluyeron 100 pacientes españoles y 100 cubanos con dispepsia a los que se les realizó una gastroscopia para el estudio de sus síntomas. H. pylori se detectó mediante la prueba de la ureasa rápida. Se determinó el fenotipo CagA de la cepa (mediante Western blot). Se evaluó la estrategia 'testar y realizar endoscopia' en función de la infección por H. pylori y el fenotipo CagA de la cepa. RESULTADOS: La edad media (DE) de los pacientes españoles y cubanos fue de 45 (16) y 46 (15) años, respectivamente. Los síntomas de dispepsia fueron similares en ambos grupos. La prevalencia de infección por H. pylori fue más alta en Cuba (73 por ciento) que en España (40 por ciento) (p < 0,01). La prevalencia del fenotipo CagA+ fue también más elevada en Cuba (el 81 frente al 27 por ciento) (p < 0,01). El 11 por ciento de los pacientes españoles CagA+ tenía úlcera duodenal, mientras que esta lesión no se demostró en ninguno de los pacientes CagA- (p < 0,05). La prevalencia de úlcera duodenal en los pacientes cubanos CagA+ y CagA- fue del 31 y del 0 por ciento (p < 0,05). Aplicando la estrategia 'testar y realizar endoscopia' sólo se evitaría la endoscopia en el 24 por ciento de los pacientes españoles y en el 15 por ciento de los cubanos, mientras que si se excluyen los pacientes con síntomas de reflujo gastroesofágico se lograría evitar únicamente el 18 y el 11 por ciento de las endoscopias, respectivamente. CONCLUSIONES: La prevalencia de infección por H. pylori es más alta en los pacientes cubanos con dispepsia que en los españoles. Las cepas de H. pylori de Cuba parecen ser más virulentas que las de España. La proteína CagA es un marcador de úlcera péptica en ambas poblaciones. Las diferencias encontradas podrían explicar parcialmente las variaciones en la prevalencia de las diversas enfermedades gastroduodenales entre ambos países. La estrategia 'testar y realizar endoscopia' podría evitar únicamente un reducido número de endoscopias (AU)