Estandarización de PCR en tiempo real para detección y cuantificación de los oncogenes E7 de seis Virus del Papiloma Humano de Alto Riesgo

El cáncer de cuello uterino es causado por la infección persistente del epitelio cervical con los genotipos de alto riesgo del Virus del Papiloma Humano. Para su detección se realizan pruebas moleculares que detectan el gen L1 del VPH. Este gen puede perderse hasta en el 11 % de los casos durante la integración del ADN viral en el genoma del hospedero originando falsos negativos. Por otra parte, el oncogén E7 se expresa durante todas las etapas de progresión de la enfermedad. El objetivo de este trabajo fue estandarizar una PCR en tiempo real del oncogén E7 (E7-qPCR) para genotipificación y cuantificación de 6 VPH-AR. Los resultados muestran que la E7- qPCR amplificó VPH-16, -18, -31, -33, -35 y -45 con una alta sensibilidad con límites de detección desde 102 copias, eficiencias entre 90 y 110 %, valores R2 > 0,97 y análisis de curva de fusión que revelan productos específicos.

Cervical cancer is caused by persistent infection of the cervical epithelium with the high-risk genotypes of the Human Papilloma Virus (HR-HPV). For its detection, molecular tests are carried out that detect the L1 gene of HPV. This gene can be lost in up to 11 % of cases during the integration of viral DNA into the host genome, causing false negatives. On the other hand, the E7 oncogene is expressed during all stages of disease progression. The aim of this work was to standardize a real-time PCR of the E7 oncogene (E7-qPCR) for genotyping and quantification of 6 HR-HPV. The results show that the E7-qPCR amplified HPV-16, -18, -31, -33, -35 and -45 with high sensitivity with detection limits from 102 copies, efficiencies between 90 and 110 %, R2 values >0,97 and melting curve analysis revealing specific products.

Report of two events of nosocomial outbreak and pseudo-outbreak due to contamination with Achromobacter spp / Comunicación de 2 eventos de brote y seudobrote nosocomial debido a contaminación con Achromobacter spp

Abstract Achromobacter spp. are increasingly recognized as emerging pathogens in immunocompromised patients or suffering cystic fibrosis, but unusual in immunocompetent hosts or individuals that underwent surgery. In this study we describe two simultaneous events attributable to two different Achromobacter spp. contaminated sources. One event was related to an episode of pseudo-bacteremia due to sodium citrate blood collection tubes contaminated with Achromobacter insuavis and the other to Achromobacter genogroup 20 infection and colonization caused by an intrinsically contaminated chlorhexidine soap solution. Both threatened the appropriate use of antimicrobials. Molecular approaches were critical to achieving the accurate species identification and to assess the clonal relationship, strengthening the need for dedicated, multidisciplinary and collaborative work of microbiologists, specialists in infectious diseases, epidemiologists and nurses in the control of infections to clarify these epidemiological situations.

Resumen Achromobacter spp. son reconocidas con mayor frecuencia como patógenos emergentes en pacientes con fibrosis quística e inmunodeprimidos, pero son inusuales en hospedadores inmunocompetentes o quirúrgicos. En este estudio describimos 2 eventos simultáneos atribuibles a 2 fuentes contaminadas con Achromobacter spp. Uno correspondió a un episodio de seudobacteriemia por tubos de citrato de sodio contaminados con Achromobacter insuavis y el otro a infecciones y colonizaciones debidas al uso de solución jabonosa de clorhexidina intrínsecamente contaminada con Achromobacter genogrupo 20. Ambos episodios pusieron en peligro el uso apropiado de antimicrobianos. Los enfoques moleculares fueron fundamentales para lograr la identificación precisa de las especies y evaluar la relación clonal de los aislamientos, lo que refuerza la necesidad del trabajo perseverante y multidisciplinario de microbiólogos, especialistas en enfermedades infecciosas, epidemiólogos y enfermeras en el control de infecciones para el esclarecimiento de estas situaciones epidemiológicas.

Virus de papiloma humano y lesión intraepitelial cervical enadolescentes embarazadas / Human papilloma virus and cervical intraepithelial lesion inpregnant adolescents

Objetivo: Comparar la presencia del Virus de Papiloma Humano (VPH) y de lesión Intraepitelial Cervical (LIE) en adolescentes embarazadas y no grávidas atendidas en la Maternidad Dr. Armando Castillo Plaza de Maracaibo, Venezuela. Método: Investigación comparativa con diseño no experimental transeccional y de campo; donde se incluyeron 46 adolescentes embarazadas (casos) y 46adolescentes no embarazadas (controles), escogidas mediante muestreo probabilístico aleatorio, a quienes se les realizó identificación de factores asociados a la patología, evaluación por citología cervicovaginal y Genotipificación del VPH por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Resultados: se encontró que 32,6% de las embarazadas presentaron LIE de bajo grado (VPH o NIC 1) respecto a 21,7% en las no grávidas, común riesgo dos veces mayor (OR [IC95%]= 2,44 [1,05-5,65]). El diagnóstico molecular resultó positivo en la mitad del total de la muestra, siendo mayor en las embarazadas (52,1 vs. 47,9p<0,05);predominado las infecciones pro genotipos de alto riesgo 47,8vs 30,5; p <0,05). El VPH 16 resulto el más prevalente entre las embarazadas (21,7%) y la co-infección por genotipos debajo riesgo (6-11) en las no grávidas (17,4%) Conclusiones: las embarazadas adolescentes presentan una mayor prevalencia de LIE e infección genital por VPH, asociado a un riesgo significativo del doble de probabilidad de presentar una LIE respecto a las adolescentes no grávidas(AU)

Aim: To compare the presence of Human PapillomaVirus (HPV) and Squamous Intraepithelial Lesion (SIL)in pregnant and non-pregnant adolescents treated at the "Maternidad Dr. Armando Castillo Plaza" in Maracaibo, Venezuela. Patients and Methods: A comparative research with non-experimental transectional and field design was performed; where 46 pregnant adolescents (cases) and 46 non-pregnant adolescents (controls) was included, chosen by random probability sampling, who under went identification off actors associated with the pathology, evaluation by pap-smearand HPV genotyping by chain reaction of polymerase (PCR). Results: It was found that 32.6% of pregnant women had lowgrade SIL ( HPV or CIN 1) compared to 21.7% in non-pregnant women, with a risk twice higher (OR [95% CI] = 2.44 [1.05-5.65]). thee molecular diagnosis was positive in half of the total sample, being higher in pregnant women (52.1 vs. 47.9p <0.05);infections with high-risk genotypes predominated 47.8 vs 30.5;p <0.05). HPV 16 was the most prevalent among pregnant women (21.7%) and co-infection by low-risk genotypes (6-11) in non-pregnant women (17.4%). Conclusions: adolescent pregnant women have a higher prevalence of LIE and genital HPV infection, associated with a significant risk of twice the probability of presenting an LIE compared to non-pregnant adolescents(AU)

Assessment of genotyping markers in the molecular characterization of a population of clinical isolates of Fusarium in Colombia / Evaluación de marcadores de genotipificación en la caracterización molecular de una población de aislamientos clínicos de Fusarium en Colombia

Introduction: Fusarium is a very heterogeneous group of fungi, difficult to classify, with a wide range of living styles, acting as saprophytes, parasites of plants, or pathogens for humans and animals. Prevalence of clinical fusariosis and lack of effective treatments have increased the interest in the precise diagnosis, which implies a molecular characterization of Fusarium populations. Objective: We compared different genotyping markers in their assessment of the genetic variability and molecular identification of clinical isolates of Fusarium. Materials and methods: We evaluated the performance of the fingerprinting produced by two random primers: M13, which amplifies a minisatellite sequence, and (GACA)4, which corresponds to a simple repetitive DNA sequence. Using the Hunter Gaston Discriminatory Index (HGDI), an analysis of molecular variance (AMOVA), and a Mantel test, the resolution of these markers was compared to the reference sequencing-based and PCR genotyping methods. Results: The highest HGDI value was associated with the M13 marker followed by (GACA)4. AMOVA and the Mantel tests supported a strong correlation between the M13 classification and the reference method given by the partial sequencing of the transcription elongation factor 1-alpha (TEF1-α) and rDNA 28S. Conclusion: The strong correlation between the M13 classification and the sequencing-based reference together with its higher resolution demonstrates its adequacy for the characterization of Fusarium populations.

Introducción. Fusarium es un grupo heterogéneo de hongos, difícil de clasificar y con una amplia gama de estilos de vida, que actúa como saprófito, parásito de plantas o patógeno de humanos y animales. La prevalencia de la fusariosis clínica y la falta de tratamientos han incrementado el interés en su diagnóstico preciso, lo que conlleva la caracterización molecular de las poblaciones. Objetivo. Comparar marcadores de genotipificación en la evaluación de la variabilidad genética e identificación de aislamientos clínicos de Fusarium. Materiales y métodos. Se evaluó la huella genética producida por dos cebadores aleatorios: M13, que amplifica una secuencia minisatélite, y (GACA)4, que corresponde a una secuencia repetitiva de ADN. Utilizando el índice discriminatorio de Hunter Gaston (HGDI), el análisis de varianza molecular (AMOVA) y una prueba de Mantel, se comparó la resolución de estos marcadores con métodos de genotipificación basados en secuenciación y PCR. Resultados. El mayor HGDI se asoció con el marcador M13, seguido de (GACA)4. Las pruebas AMOVA y Mantel mostraron correlación entre las clasificaciones obtenidas con M13 y la referencia basada en la secuenciación parcial del factor de elongación de transcripción 1-alfa (TEF1-α) y el ADNr 28S. Conclusión. La fuerte correlación entre la clasificación obtenida con M13 y el método de referencia, así como su alta resolución, demuestran su idoneidad para la caracterización de poblaciones de Fusarium.

Report of two events of nosocomial outbreak and pseudo-outbreak due to contamination with Achromobacter spp.

Achromobacter spp. are increasingly recognized as emerging pathogens in immunocompromised patients or suffering cystic fibrosis, but unusual in immunocompetent hosts or individuals that underwent surgery. In this study we describe two simultaneous events attributable to two different Achromobacter spp. contaminated sources. One event was related to an episode of pseudo-bacteremia due to sodium citrate blood collection tubes contaminated with Achromobacter insuavis and the other to Achromobacter genogroup 20 infection and colonization caused by an intrinsically contaminated chlorhexidine soap solution. Both threatened the appropriate use of antimicrobials. Molecular approaches were critical to achieving the accurate species identification and to assess the clonal relationship, strengthening the need for dedicated, multidisciplinary and collaborative work of microbiologists, specialists in infectious diseases, epidemiologists and nurses in the control of infections to clarify these epidemiological situations.

Detección y genotipificación del virus del papiloma humano de alto riesgo mediante PCR multiplex en tiempo real (RT-PCR VPH AR) / High risk human papillomavirus detection and genotyping by multiplex real time PCR (RT-PCR HR HPV)

Utilidad clínica de la prueba La relación causal entre el desarrollo de cáncer de cérvix y la infección con genotipos de alto riesgo (AR) del virus del papiloma humano (VPH), ha llevado al desarrollo de estrategias para su detección y caracterización genotípica, como una medida de prevención de este tipo de cáncer. Dado que la presencia del VPH no puede ser determinada mediante los hallazgos clínicos de la paciente, como tampoco en los hallazgos morfológicos en la citología ni en la detección de anticuerpos específicos contra el VPH (pruebas serológicas), su detección y genotipificación recaen en el uso de pruebas moleculares, las cuales en su mayoría están dirigidas a la detección del ADN de los genotipos de alto riesgo, usando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional y en tiempo real (RT-PCR) [1]. La técnica de PCR permite la amplificación de regiones específicas del ADN del VPH en los genes L1, E6 y E7, los cuales, por sus variaciones en la secuencia, permiten la genotipificación del virus [2,3]. Las pruebas de detección de ADN y/o genotipificación del VPH son consideradas herramientas de tamización en cáncer de cérvix, que detectan la infección causada por VPH. Su aplicación está enfocada en la clasificación de anormalidades citológicas, monitoreo de infecciones persistentes, seguimiento postratamiento de lesiones intraepiteliales de alto grado y vigilancia epidemiológica en salud pública [4-6]. La utilización de la citología y las pruebas de detección de ADN del VPH, aumenta la sensibilidad de la tamización para la detección de cáncer de cérvix y reduce de manera significativa el riesgo de sufrir lesiones cervicales premalignas por un periodo de 5 años [2,7]

Evaluation of the melting temperature of TaqMan probes as a genotyping method for IDH1, IDH2, and H3F3A in pediatric astrocytomas / Evaluación del método de temperatura de disociación de sondas TaqMan para la genotipificación de IDH1, IDH2 y H3F3A en astrocitomas pediátricos

Abstract Background: Astrocytomas are cancer tumors of the central nervous system and represent the most common type of solid tumors during human childhood. In 2016, the World Health Organization established a molecular classification system to regroup tumor entities to achieve a more accurate diagnosis and a better clinical decision-making and selection of treatment in patients with these types of tumors. Methods: We evaluated a genotyping assay for rapid and cost-effective mutation detection in astrocytomas using TaqMan probes in an asymmetric polymerase chain reaction (PCR) assay. Results: Four diffuse astrocytomas (Grade II), three anaplastic astrocytomas (Grade III), and four glioblastomas (Grade IV) were sequenced, and all of them displayed the wild-type (WT) sequence. We tried to set up this melting analysis for the genotyping of pediatric astrocytomas by identifying the specific melting temperatures of the TaqMan probes due to the presence of the WT sequences in the isocitrate dehydrogenase 1 and 2 (IDH1 and IDH2) and H3.3 histone A genes (H3F3A). We used an IDH1-TaqMan probe to identify the WT status of IDH1 in two different WT deoxyribonucleic acid (DNA) templates (pilocytic and diffuse astrocytoma) and obtained four melting temperature values ranged from 65.6 to 92.2°C. Furthermore, only four out of 29 reactions displayed amplification of the DNA template. Sanger sequencing was faster and more reliable to detect the gene status in all the sequenced samples. Conclusions: We conclude that conventional Sanger sequencing remains the gold standard for the genotyping of pediatric astrocytomas.

Resumen Introducción: Los astrocitomas son un tipo de cáncer que afecta al sistema nervioso central y representan el tumor sólido más común durante la infancia. En el año 2016, la Organización Mundial de la Salud estableció un sistema de clasificación molecular para reagrupar tumores con identidades genéticas similares y lograr un diagnóstico más preciso, lo que lleva a tomar las decisiones clínicas idóneas al elegir el tratamiento de pacientes con este tipo de tumores. Métodos: Se evaluó un protocolo que involucra el uso de sondas TaqMan en un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa asimétrica para la detección de mutaciones en astrocitomas. Se secuenciaron cuatro astrocitomas difusos (Grado II), tres astrocitomas anaplásicos (Grado III) y cuatro glioblastomas (Grado IV). Se intentó establecer las condiciones del análisis para la genotipificación de los astrocitomas pediátricos mediante la identificación de las temperaturas de disociación específicas de las sondas TaqMan producidas por la prescencia de las secuancias WT en los genes isocitrato deshidrogenasa 1 y 2 (IDH1, IDH2) y H3.3 histona A (H3F3A). Resultados: Los astrocitomas mostraron la secuencia wild type (WT) (silvestre) de los genes. Se utilizó una sonda TaqMan IDH1 para identificar el estado de este gen en dos templados WT de DNA (astrocitoma pilocítico y difuso) y se obtuvieron cuatro valores de temperatura de disociación (65.6-92.2 °C). Solo cuatro de las 29 reacciones mostraron amplificación de DNA. La secuenciación de Sanger fue más rápida y confiable para detectar el estado de los genes en todas las muestras. Conclusiones: La secuenciación de Sanger sigue siendo la técnica más práctica para la genotipificación de astrocitomas pediátricos.

Evaluation of the melting temperature of TaqMan probes as a genotyping method for IDH1, IDH2, and H3F3A in pediatric astrocytomas.

Background: Astrocytomas are cancer tumors of the central nervous system and represent the most common type of solid tumors during human childhood. In 2016, the World Health Organization established a molecular classification system to regroup tumor entities to achieve a more accurate diagnosis and a better clinical decision-making and selection of treatment in patients with these types of tumors. Methods: We evaluated a genotyping assay for rapid and cost-effective mutation detection in astrocytomas using TaqMan probes in an asymmetric polymerase chain reaction (PCR) assay. Results: Four diffuse astrocytomas (Grade II), three anaplastic astrocytomas (Grade III), and four glioblastomas (Grade IV) were sequenced, and all of them displayed the wild-type (WT) sequence. We tried to set up this melting analysis for the genotyping of pediatric astrocytomas by identifying the specific melting temperatures of the TaqMan probes due to the presence of the WT sequences in the isocitrate dehydrogenase 1 and 2 (IDH1 and IDH2) and H3.3 histone A genes (H3F3A). We used an IDH1-TaqMan probe to identify the WT status of IDH1 in two different WT deoxyribonucleic acid (DNA) templates (pilocytic and diffuse astrocytoma) and obtained four melting temperature values ranged from 65.6 to 92.2°C. Furthermore, only four out of 29 reactions displayed amplification of the DNA template. Sanger sequencing was faster and more reliable to detect the gene status in all the sequenced samples. Conclusions: We conclude that conventional Sanger sequencing remains the gold standard for the genotyping of pediatric astrocytomas.

Introducción: Los astrocitomas son un tipo de cáncer que afecta al sistema nervioso central y representan el tumor sólido más común durante la infancia. En el año 2016, la Organización Mundial de la Salud estableció un sistema de clasificación molecular para reagrupar tumores con identidades genéticas similares y lograr un diagnóstico más preciso, lo que lleva a tomar las decisiones clínicas idóneas al elegir el tratamiento de pacientes con este tipo de tumores. Métodos: Se evaluó un protocolo que involucra el uso de sondas TaqMan en un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa asimétrica para la detección de mutaciones en astrocitomas. Se secuenciaron cuatro astrocitomas difusos (Grado II), tres astrocitomas anaplásicos (Grado III) y cuatro glioblastomas (Grado IV). Se intentó establecer las condiciones del análisis para la genotipificación de los astrocitomas pediátricos mediante la identificación de las temperaturas de disociación específicas de las sondas TaqMan producidas por la prescencia de las secuancias WT en los genes isocitrato deshidrogenasa 1 y 2 (IDH1, IDH2) y H3.3 histona A (H3F3A). Resultados: Los astrocitomas mostraron la secuencia wild type (WT) (silvestre) de los genes. Se utilizó una sonda TaqMan IDH1 para identificar el estado de este gen en dos templados WT de DNA (astrocitoma pilocítico y difuso) y se obtuvieron cuatro valores de temperatura de disociación (65.6-92.2 °C). Solo cuatro de las 29 reacciones mostraron amplificación de DNA. La secuenciación de Sanger fue más rápida y confiable para detectar el estado de los genes en todas las muestras. Conclusiones: La secuenciación de Sanger sigue siendo la técnica más práctica para la genotipificación de astrocitomas pediátricos.

Frequency and geographical distribution of genotypes and mating types of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii species complexes in Argentina / Frecuencia y distribución geográfica de genotipos y tipos sexuales de los complejos de especies Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii en Argentina

Abstract The aim of this work was to know the frequency and geographical distribution of genotypes and mating types of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii species complexes isolated from human infections in Argentina during the period from April 2009 to April 2011. A multicenter study was conducted, in which 372 isolates were obtained from 61 laboratories throughout the country. Of those, 98.8% of the isolates belonged to the C. neoformans species complex and 1.1% to the C. gattii species complex. Genotype VNI (MATa) was the most frequently isolated (n = 326, 87.6%), followed by VNII (MATa) (n = 22, 5.9%), the recently described VNII-VNIV (aADa) hybrid (n = 14, 3.8%), VNIV (MATa) (n=4, 1.1%), VNIII (aADa) hybrid (n = 1, 0.3%), and VNIII (aADa) hybrid (n = 1, 0.3%). The Argentine Central region showed the greatest number of cases and genotype diversity. Interestingly, a relative high frequency was observed in genotype VNII (MATa) in the Cuyo, Northeast and Northwest regions and, also in VNII-VNIV (aADa) hybrids in the Northwest region. C. gattii species complex was isolated at a low rate; 3 VGI (MATa) and 1 VGII (MATa) isolates were obtained from the Northwest and Central regions. In conclusion, this study shows that genotype frequencies seem to vary among regions in Argentina and reveals a relatively high frequency of rare hybrids in the Northwest region. Further regional clinical and environmental studies may help to elucidate if those varia-tions in frequencies are associated with the existence of regional ecological niches or any other regional factors.

Resumen El objetivo de! trabajo fue conocer la frecuencia y la distribución geográfica de genotipos y tipos sexuales de aislados pertenecientes a los complejos de especies Cryptococcus neoformansy Cryptococcus gattii obtenidos de infecciones humanas en Argentina. Entre abril de 2009 y abril de 2011 se realizó un estudio multicéntrico del que se obtuvieron 372 aislados de 61 laboratorios de diferentes zonas del país. El 98,8% de los aislados pertenecieron al complejo C. neoformansy el 1,1% al complejo C. gattii. El genotipo VNI (MATa) fue el más frecuente (n = 326; 87,6%), le siguieron VNII (MATa) (n = 22; 5,9%), el híbrido VNII-VNIV (aADa) (n = 14; 3,8%), VNIV (MATa) (n =4; 1,1%) y los híbridos VNIII (aADa) (n = 1; 0,3%) y VNIII (aADa) (n = 1; 0,3%). La región Centro mostró el mayor número de casos y la mayor diversidad de genotipos. Cabe destacar que el genotipo VNII (MATa) tuvo una frecuencia relativamente alta en las regiones de Cuyo, Noreste y Noroeste. En esta última región, también fue alta la frecuencia del híbrido VNII-VNIV (aADa). La frecuencia de aislamiento de miembros del complejo C. gattii fue baja: se obtuvieron 3 aislados VGI (MATa) y 1 VGII (MATa) de las regiones Centro y Noroeste. En conclusión, este estudio muestra que las frecuencias de genotipos varían entre las distintas regiones de Argentina y señala la presencia de híbridos poco comunes en una frecuencia relativamente alta dentro de la región Noroeste. Contar con mayor número de estudios clínicos y ambientales regionales podría ayudar a elucidar si tales variaciones están asociadas a la existencia de nichos ecológicos particulares o a algún otro factor regional.

Diversity of Achromobacter species recovered from patients with cystic fibrosis, in Argentina / Diversidad de las especies de Achromobacter recuperadas de pacientes con fibrosis quística en Argentina

Abstract Different phenotype-based techniques and molecular tools were used to describe the distribution of different Achromobacter species in patients with cystic fibrosis (CF) in Argentina, and to evaluate their antibiotic resistance profile. Phenotypic identification was performed by conventional biochemical tests, commercial galleries and MALDI-TOF MS. Genetic approaches included the detection of A. xylosoxidans specific marker blaoxa-114, the amplificaron and sequencing of the 16S rRNA gene, nrdA and blaOXA complete sequence, and MLST analysis. Phenotypic approaches, even MALDI-TOF, rendered inconclusive or misleading results. On the contrary, concordant results were achieved with the nrdA sequencing or sequence type (ST) analysis, and the complete blaOXA sequencing, allowing a reliable discrimination of different Achromobacter species. A. xylosoxidans accounted for 63% of Achromobacter infections and A. ruhlandii accounted for 17%. The remaining species corresponded to A. insuavis, A. dolens, A. marplatensis and A. pulmonis. Antimicrobial susceptibilities were determined by the agar dilution method according to CLSI guidelines. Piperacillin, piperacillin/tazobactam and car-bapenems were the most active antibiotics. However, the emergence of carbapenem-resistant isolates was detected. In conclusion, prompt and accurate identification tools were necessary to determine that different Achromobacter species may colonize/infect the airways of patients with CF. Moreover, antimicrobial therapy should be administered based on the susceptibility profile of individual Achromobacter sp. isolates. © 2019 Asociación Argentina de Microbiología. Published by Elsevier España, S.L.U. This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Resumen Se emplearon diversas técnicas fenotípicas y moleculares para describir la distribución de diferentes especies del género Achromobacter en pacientes con fibrosis quística (FQ) en Argentina, y se evaluó el perfil de resistencia a los antibióticos. Se realizó la identificación fenotípica por pruebas bioquímicas convencionales, galerías comerciales y MALDI-TOF MS. El enfoque genético incluyó la detección del marcador especie-específico de A. xylosoxidans bla[PRESERVECIRC]tu, la amplificación y la secuenciación de los genes ARNr 16S, nrdA y secuencia completa de blaOXA, y el análisis por MLST. Los enfoques fenotípicos, incluso la técnica de MALDI-TOF, proporcionaron resultados no concluyentes o erróneos. Por el contrario, se obtuvieron resultados concordantes entre la secuenciación del gen nrdA o el análisis de secuenciotipos (ST) y la secuenciación completa de blaOXA, lo que permitió una discriminación confiable de las diferentes especies de Achromobacter. A. xylosoxidans representó el 63% de las infecciones por Achromobacter y A. ruhlandii representó el 17%. Las especies restantes correspondieron a A. insuavis, A. dolens, A. marplatensis y A. pulmonis. Se determinó la sensibilidad a antimicrobianos por el método de dilución en agar de acuerdo al CLSI. Los antibióticos más activos fueron piperacilina, piperacilina/tazobactam y carbapenemes. Sin embargo, se detectó la emergencia de aislamientos resistentes a carbapenemes. En conclusión, resultaron necesarias herramientas de identificación rápida y precisas para determinar las diferentes especies del género Achro-mobacter capaces de colonizar/infectar las vías respiratorias de los pacientes con FQ. Asimismo, la terapia antimicrobiana debería llevarse a cabo en función del perfil de sensibilidad de los aislamientos individuales de Achromobacter spp. © 2019 Asociacion Argentina de Microbiología. Publicado por Elsevier Espana, S.L.U. Este es un artículo Open Access bajo la licencia CC BY-NC-ND (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Frequency and geographical distribution of genotypes and mating types of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii species complexes in Argentina.

The aim of this work was to know the frequency and geographical distribution of genotypes and mating types of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii species complexes isolated from human infections in Argentina during the period from April 2009 to April 2011. A multicenter study was conducted, in which 372 isolates were obtained from 61 laboratories throughout the country. Of those, 98.8% of the isolates belonged to the C. neoformans species complex and 1.1% to the C. gattii species complex. Genotype VNI (MATα) was the most frequently isolated (n=326, 87.6%), followed by VNII (MATα) (n=22, 5.9%), the recently described VNII-VNIV (aADα) hybrid (n=14, 3.8%), VNIV (MATα) (n=4, 1.1%), VNIII (αADa) hybrid (n=1, 0.3%), and VNIII (αADα) hybrid (n=1, 0.3%). The Argentine Central region showed the greatest number of cases and genotype diversity. Interestingly, a relative high frequency was observed in genotype VNII (MATα) in the Cuyo, Northeast and Northwest regions and, also in VNII-VNIV (aADα) hybrids in the Northwest region. C. gattii species complex was isolated at a low rate; 3 VGI (MATα) and 1 VGII (MATα) isolates were obtained from the Northwest and Central regions. In conclusion, this study shows that genotype frequencies seem to vary among regions in Argentina and reveals a relatively high frequency of rare hybrids in the Northwest region. Further regional clinical and environmental studies may help to elucidate if those variations in frequencies are associated with the existence of regional ecological niches or any other regional factors.

Diversity of Achromobacter species recovered from patients with cystic fibrosis, in Argentina.

Different phenotype-based techniques and molecular tools were used to describe the distribution of different Achromobacter species in patients with cystic fibrosis (CF) in Argentina, and to evaluate their antibiotic resistance profile. Phenotypic identification was performed by conventional biochemical tests, commercial galleries and MALDI-TOF MS. Genetic approaches included the detection of A. xylosoxidans specific marker blaoxa-114, the amplification and sequencing of the 16S rRNA gene, nrdA and blaOXA complete sequence, and MLST analysis. Phenotypic approaches, even MALDI-TOF, rendered inconclusive or misleading results. On the contrary, concordant results were achieved with the nrdA sequencing or sequence type (ST) analysis, and the complete blaOXA sequencing, allowing a reliable discrimination of different Achromobacter species. A. xylosoxidans accounted for 63% of Achromobacter infections and A. ruhlandii accounted for 17%. The remaining species corresponded to A. insuavis, A. dolens, A. marplatensis and A. pulmonis. Antimicrobial susceptibilities were determined by the agar dilution method according to CLSI guidelines. Piperacillin, piperacillin/tazobactam and carbapenems were the most active antibiotics. However, the emergence of carbapenem-resistant isolates was detected. In conclusion, prompt and accurate identification tools were necessary to determine that different Achromobacter species may colonize/infect the airways of patients with CF. Moreover, antimicrobial therapy should be administered based on the susceptibility profile of individual Achromobacter sp. isolates.

Resistance to antiretroviral therapy (ART) in patients with HIV/AIDS after therapeutic failure / Resistencia a la terapia antirretroviral (TAR) en pacientes VIH/SIDA en fracaso terapéutico

Abstract Introduction: HIV replication and the suboptimal use of antiretrovirals are directly related to the appearance of resistant mutations. The objective of this study was to describe the resistance mutations (RMs) present in HIV infected patients who experienced antiretroviral treatment failure between 2002 and 2015 in Cali, Colombia. Method: 403 genotypes of adult patients with HIV/AIDS who received ART and experienced virological failure were analyzed. With informed consent, resistance genotype testing was performed using TRUGENE HIV-1; the RMs were defined according to the International AIDS Society-2015 list. The sample was subdivided by periods (2002-2006 vs 2007-2015) and early versus late genotyping. Mutations with ≥15 points to some ARV were considered, according to the Stanford HIV database. Results: comparing the periods, there were more RMs for non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) in 2007-2015 than in 2002-2006 (85% vs. 60%, respectively, p<0.0001), but protease inhibitors were less affected in 2007-2015 than in 2002-2006 (11% vs. 29%, respectively, p < 0.001). The M184V and K103 N mutations were the most frequent RMs in reverse transcriptase (RT) for NRTIs and NNRTIs, respectively. A total of 67.5% were early genotypes. There was a higher prevalence of certain RMs in late genotypes compared to early ones, mainly for RMs to PIs (D30N, L90M) and NRTIs (M41L, D67N, K70R, L210W); but a lower prevalence of RMs to NNRTIs (Y181C). Conclusion: the late resistance genotypes were associated with higher levels of resistance mutations, mainly to the NNRTI and NRTI families, limiting their use as a rescue therapy alternative. (Acta Med Colomb 2019; 44. DOI:https://doi.org/10.36104/amc.2019.1546).

Resumen Introducción: la replicación del VIH y la utilización subóptima de antirretrovirales, se relacionan directamente con la aparición de mutaciones de resistencias. el objetivo del estudio fue describir las mutaciones de resistencia (mdr) presentes en pacientes infectados por vih que fracasaron a la terapia antirretroviral entre 2002 y 2015 en cali, colombia. Metodología: se analizaron 403 genotipos de pacientes adultos con VIH/SIDA que recibían TAR y experimentaban fracaso virológico. Bajo consentimiento informado, se llevó a cabo la prueba de genotipo de resistências usando TRUGENE HIV-1, se definieron las MDR según el listado de International AIDS Society-2015. Se subdividió la muestra por periodos (2002-2006 vs 2007-2015) y momento de genotipificación temprano versus tardio. Mutaciones con ≥15 puntos a algún ARV fueron consideradas, según la HIV-database de Stanford. Resultados: comparando los periodos, en 2007-2015 hubo mayor afectación de MDR para los inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa reversa (ITINAN) frente a 2002-2006 (85% vs. 60%, respectivamente, p<0.0001), pero menor afectación en 2007-2015 frente a 2002-2006 para inhibidores de la proteasa (11% vs. 29%, respectivamente p < 0.001). Mutaciones M184V y K103N fueron las MDR más frecuentes en la retrotranscriptasa (RT) para ITIAN e ITINAN, respectivamente. El 67.5% fueron genotipos considerados tempranos. Mayor prevalencia de ciertas MDR cuando el genotipo fue tardío frente al temprano, principalmente para MDR a IP (D30N, L90M), ITIAN (M41L, D67N, K70R, L210W), pero menor para MDR a ITINAN (Y181C). Conclusion: los estudios de genotipo de resistencias realizados tardiamente, se asociaron con mayores niveles de mutaciones que confieren resistencias, principalmente a las familias de ITINAN e ITIAN, limitando su uso como alternativa terapéutica de rescate. (Acta Med Colomb 2019; 44. DOI:https://doi.org/10.36104/amc.2019.1546).

Prueba de concepto de una pcr multiplex de primera generación (cualitativa) para detección del oncogén e7 de vphs de alto riesgo

Introducción: Infección persistente con el virus de papiloma humano de alto riesgo (VPH-AR) causa cáncer de cuello uterino (CCU). Existen ensayos moleculares para la detección y la genotipificación del gen L1 de VPH, sin embargo, L1 puede perderse durante la integración viral. La expresión e integración del oncogén E7 es fundamental para el desarrollo de CCU. Objetivo: Estandarizar una PCR multiplex (mPCR) del oncogén E7 (E7-mPCR) para genotipificación de los VPH-AR de mayor frecuencia en CCU (VPH-16, -18, -31, -33, -45 y -52). Métodos: Se obtuvieron cepillados cervicales de voluntarias y se analizaron amplificando por PCR el gen L1 con subsecuente hibridación reversa. Posteriormente, se escogieron 59 muestras positivas para VPH-AR y se analizaron por E7-mPCR. Resultados: Se evidenció una elevada concordancia entre los resultados del ensayo E7- mPCR y los de la PCR de L1 (concordancia observada de 95,1%, Kappa de Cohen = 0,88), encontrándose mayor número de infecciones por VPH- AR en el 15,8% con E7-mPCR. Conclusión: E7-mPCR es una herramienta diagnóstica con alta concordancia y económica que puede adaptarse a una plataforma de mayor complejidad para procesar y detectar mayor cantidad de muestras y genotipos de VPH-AR.

Introduction: The persistent infection of the high-risk Human Papiloma Virus (VPH-AR in Spanish) causes uterine cervix cancer (CCU in Spanish). There are molecular essays for detection and genotyping of gen L1 of VPH. However, L1 may get lost during the viral integration. The expression and integration of oncogene E7 is fundamental for the development of CCU. Objective: To standardize a multiplex PCR (mPCR) of oncogene E7 (E7-mPCR) for genotyping the VPH- AR of highest frequency in CCU (VPH-16, -18, -31, -33, -45 y -52). Method: We obtained cervix brushing simples from volunteers and we analyzed them by amplifying the L1 gene through PCR with a subsequent reverse hybridization. After that, we chose 59 positive VPH- AR samples and we analyzed them for E7-mPCR. Results: We found out a high concordance between the results of the essay E7-mPCR and those of L1 PC (Observed concordance was of 95.1%, Cohen's Kappa = 0.88), and we revealed a higher number of infections for VPH-AR in a 15.8% with E7-mPCR. Conclusion: E7-mPCR is an economic diagnostic tool with high concordance which can be adapted to a platform with more complexity to process and detect a higher number of samples and VPH-AR genotypes.

Introdução: a infecção persistente com o virus de papiloma humano de alto risco (HPV-AR) causa cáncer de colo do útero (CCU). Existem ensaios moleculares para detecção e para a genotipificação do gene L1 de HPV; contudo, L1 pode ser perdido durante a integrado viral. A expressão e integração do oncogênese E7 é fundamental para o desenvolvimento do CCU. Objetivo: padronizar uma PCR multiplex (mPCR) do oncogênese E7 (E7-mPCR) para genotipificação dos HPV-AR de maior frequência no CCU (HPV-16, -18, -31, -33, -45 e -52). Métodos: foram realizadas raspagens com escova cervical rodada em voluntárias e foram analisadas a partir da amplificação do gene L1 por PCR com subsequente hibridação inversa. Em seguida, foram escolhidas 59 amostras positivas para HPV-AR, as quais foram analisadas por E7-mPCR. Resultados: foi evidenciada elevada concordância entre os resultados do ensaio E7-mPCR e os da PCR de L1 (concordância observada de 95,1%, Kappa de Cohen = 0,88), encontrando-se maior número de infecções por HPV-AR em 15,8% com E7-mPCR. Conclusão: E7-mPCR é uma ferramenta diagnóstica com alta concordância e económica que pode ser adaptada a uma plataforma de maior complexidade para processar e detectar maior quantidade de amostras e genótipos de HPV-AR.

Distribution of polymorphism rs693 of ApoB gene in a sample of Colombian Caribbeans / Distribución del polimorfismo rs693 en el gen de la apolipoproteína B en una muestra caribeños colombianos

Abstract Introduction: Several studies have reported that the single nucleotide polymorphism rs693 of Apo lipoprotein B gene is associated with high levels of plasma lipids and high body mass index, which are risk factors for cardiovascular diseases. The distribution of this single nucleotide polymorphism and its association with the phenotype depend on the genetic background of each population. Objective: To evaluate the distribution of single nucleotide polymorphism rs693 and its association with lipid profile and body mass index in a sample of Colombian Caribbeans. Methods: 108 non-related adult subjects of both gender were included in this study. Body mass index and lipid profile that included total cholesterol, triglycerides, Low Density Lipoprotein and High Density Lipoprotein were determined. The single nucleotide polymorphism rs693 was determined by Polymerase Chain Reaction/Restriction Fragment Length Polymorphism from genomic DNA followed by digestion with the restriction enzyme XbaI. The chi-square test was used to analyze the genotype distribution of rs693 and the genotype-phenotype association was evaluated through different inheritance model. Results: The genotype frequencies for single nucleotide polymorphism rs693 were CC (45.0%), TT (16.5%) and CT (38.5%). The allele frequencies were C (64.0%) and T (36.0%). The single nucleotide polymorphism was in Hardy-Weinberg equilibrium in the studied sample. No association of the single nucleotide polymorphism rs693 with lipid profile nor the body mass index was found (p >0.05). Conclusion: There is no significant association between single nucleotide polymorphism rs693 and body mass index nor lipid profile, in a sample of Colombian Caribbeans.

Resumen Introducción: Varios estudios han informado que el polimorfismo de un solo nucleótido rs693 del gen de la apolipoproteína B se asocia con altos niveles de lípidos plasmáticos e índice de masa corporal, los cuales son factores de riesgo para enfermedades cardiovasculares. La distribución de este polimorfismo y su asociación con el fenotipo dependen del antecedente genético de cada población. La población caribeña colombiana es producto de la mezcla de tres grupos étnicos principales: africano, amerindio y caucásico. Objetivo: Evaluar la distribución del polimorfismo rs693 y su asociación con el perfil lipídico y el índice de masa corporal en una muestra de sujetos caribeños colombianos. Métodos: Fueron incluidos en este estudio 108 sujetos adultos de ambos sexos y no relacionados. Se determinaron el índice de masa corporal y el perfil lipídico; de éste se incluyó colesterol total, triglicéridos, lipoproteínas de baja densidad y lipoproteína de alta densidad. El polimorfismo rs693 se determinó mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa del ADN genómico seguida por digestión con la enzima de restricción XbaI. Se utilizó la prueba de ji cuadrado para analizar la distribución del genotipo de rs693 y se evaluó la asociación genotipo-fenotipo a través de diferentes modelos de herencia. Resultados: Las frecuencias genotípicas para rs693 fueron CC (45.0%), TT (16.5%) y TC (38.5%). Las frecuencias alélicas fueron C (64.0%) y T (36.0%). El polimorfismo rs693 estaba en equilibrio de Hardy-Weinberg en la muestra estudiada y no presentó asociación con el perfil lipídico ni con el índice de masa corporal (p >0.05). Conclusión: No existe asociación significativa del polimorfismo rs693 con el índice de masa corporal ni con el perfil lipídico en una muestra de caribeños colombianos.

Evaluación genómica en ganado Holstein Colombiano, usando genotipos imputados a densidad media / Genomic Evaluation of Colombian Holstein Cattle Using Imputed Genotypes at Medium Density

RESUMEN Objetivo. El objetivo de este estudio fue determinar la precisión y el sesgo de predicción de valores genómicos directos (VGD) usando genotipos imputados a densidad media, en características productivas y reproductivas en ganado Holstein de Antioquia, Colombia. Materiales y métodos. Fueron genotipificados 31 animales con el chip Illumina BovineLD, 64 con el chip Illumina BovineSNP50v2 y 48 con el chip Illumina BovineHD. La imputación se realizó usando dos paneles de SNPs (6K y 40K) a una densidad 44K, usando el programa FINDHAP.f90 v4. Los efectos de los SNPs fueron estimados mediante el método bayes C, usando genotipos de baja densidad (6K) y genotipos imputados a una densidad media (44_imputado). La precisión y el sesgo de los VGDs fueron determinados mediante validación cruzada. Las características evaluadas fueron: producción de leche (PL), porcentaje de proteína (PRO), porcentaje de grasa (GRA), puntaje de células somáticas (SCS), intervalo entre partos (IEP) y días abiertos (DA). Resultados. Las precisiones de VGD (rpVGD.EBV) en todas las características evaluadas oscilaron entre 0.19 y 0.24 y el sesgo (bVGD.EBV) entre 0.03 y 0.16 cuando se usó el panel 6K y usando el panel 44K_imputado las precisiones fueron mayores, oscilado entre 0.24 y 0.33 y sesgo entre 0.03 y 0.26. Conclusiones. La precisión de predicción de los VGDs fue mayor cuando se usaron genotipos imputados a densidad media, en comparación con la precisión de predicción obtenida empleando genotipos de baja densidad. Por lo cual, en este estudio se concluye que la imputación de genotipos es muy útil dado que aumenta la confiabilidad de la evaluación genómica.

ABSTRACT Objective. The goal of this study was to determine the accuracy and bias of direct genomic values (DGV) using imputed genotypes at medium density in yield- and reproduction-related traits for Holstein cattle from Antioquia, Colombia. Materials and Methods. A total of 31 animals were genotyped with the Illumina BovineLD chip, 64 with Illumina BovineSNP50v2 and 48 with Illumina BovineHD. Two SNP panels (6K and 40K) were imputed to a density of 44K using the FINDHAP.f90 v4 program. The effects of the SNPs were estimated using the Bayes C method, using low-density (6K) genotypes as well as medium-density imputed genotypes (44_imputed). The accuracy and bias of the DGVs were determined by cross-validation. The evaluated traits were: milk yield (MY), percentage of protein (PP), percentage of fat (PF), somatic cell score (SCS), calving interval (CI) and open days (OD). Results. When using the 6K panel, the accuracy values for DGV (rpDGV.EBV) in all the studied traits ranged from 0.19 to 0.24, and the bias (bDGV.EBV) from 0.03 to 0.16. In contrast, using the 44K_imputed panel generated higher accuracy values ranging from 0.24 to 0.33 and a bias ranging from 0.03 to 0.26. Conclusions. The accuracy of prediction the DGV was higher with genotypes imputed to medium densities when compared to the accuracy of prediction obtained using low-density genotypes. Therefore, in this study it is concluded that the imputation of genotypes is very useful, because it improves the reliability of the genomic evaluation.

Resistencias transmitidas del VIH-1 en pacientes sin exposición previa a terapia antirretroviral (Naïve) Cali-Colombia 2008-2015 / Transmitted HIV-1 resistance in never exposed to antiretroviral therapy patients, Cali-Colombia 2008-2015

Objetivo: Determinar la frecuencia de resistencias transmitidas en pacientes VIH no expuestos a terapia antirretroviral. Metodología: Estudio transversal, entre 2008 y 2015 participaron 342 pacientes mayores de 18 años, con infección VIH-1, sin exposición a antirretrovirales, con genotipo de resistencias previo al inicio con antirretrovirales y consentimiento informado. Se incluyeron mutaciones de resistencias definidas por Organización Mundial de Salud (OMS)-2009 e internacional AIDS Society-USA 2015. Se recolectaron características sociodemográficas y clínicas relacionadas con VIH. Resultados: Edad promedio 32±10,5 años; 74% hombres. Al genotipo, mediana de carga viral 26.802 copias/mL, y 343 células T-CD4/mm3 . Según lista de Organización Mundial de Salud-2009 la frecuencia de mutaciones fue 3.2% y considerando mutaciones de internacional AIDS Society y base de datos VIH-Stanford, esta fue 7.9%. Mutaciones más comunes: K103N/S (2.1%), Q58E (2%), V108I y E138A (1.2%). Mutaciones en transcriptasa reversa 4.4% para inhibidores no nucleosídicos y 1.2% para nucleosídicos; para inhibidores de proteasa 2.3%. En pacientes con probable infección retroviral <1 año, la prevalencia de resistencias transmitidas, según la lista de OMS-2009, fue 7.3%, mientras que, con infección ≥1 año fue 1.6% (p=0.008). Conclusión: En pacientes con probable infección <1 año, la frecuencia de mutaciones transmitidas superó el umbral recomendado por la Organización Mundial de Salud para implementar genotipo de resistencias.

Introduction: This study determined the frequency of transmitted drug resistance in patients not exposed to ART, attended in Cali-Colombia. Methodology: A cross-sectional study between 2008 and 2015 involved 342 patients older than 18 years, with confirmed HIV infection, without exposure to antiretrovirals, with resistance genotype prior to initiation of antiretroviral and informed consent. Resistance mutations defined by WHO-2009 and international AIDS Society-USA 2015 were included. Sociodemographic and clinical characteristics related to HIV were also collected. Results: The mean age was 32 ± 10.5 years; 74% were men. At the time of genotype, median viral load was 26,802 copies / mL, and 343 T-CD4 / mm3 cells. According to the WHO-2009 list, the frequency of mutations was 3.2% and considering the AIDS Society-USA list and the Stanford HIV database mutations, this reached 7.9%. The most common mutations were K103N/S (2.1%), Q58E (2%), V108I and E138A (1.2%). Reverse transcriptase mutations were found in 4.4% for non-nucleoside inhibitors and 1.2% for nucleoside; for protease inhibitors were 2.3%. In patients with retroviral infection <1 year, the transmitted resistances prevalence, using only the WHO-2009 list, reach 7.3%, while in those with ≥1 year only was 1.6% (p=0.008). Conclusions: The frequency of transmitted mutations in naïve patients with retroviral infection <1 year exceeded the prevalence threshold recommended by the WHO to implement the resistance genotype.

Molecular epidemiology of tuberculosis. / Epidemiología molecular de la tuberculosis.

The application of genotyping tools allowed us to discriminate between the Mycobacterium tuberculosis isolates obtained in the laboratory. The differentiation between single strains opened the door to molecular epidemiology studies, which had helped us to progress in our knowledge of how this pathogen is transmitted in the progressively more complex socio-epidemiological scenario. The genetic stability of this microorganism led to develop specific methodologies, which are thoroughly revised in this chapter. In addition to their application in epidemiology, we review, how they can offer a response to different diagnostic and clinical challenges. Finally, we focus on describing the novel genomic revolution we are experiencing in the analysis of tuberculosis, the methodology in which it is based and the novel possibilities it offers, including new routes of integrating both the molecular and genomic languages in innovative post-genomic proposals, better suited to our real-life context.

Molecular characterization of Candida isolates from intensive care unit patients, Krakow, Poland.

BACKGROUND: Over the last decades, Candida species have emerged as important pathogens in immunocompromised patients. Nosocomial infections are mainly of endogenous origin. Nevertheless, some cases of exogenous candidiasis have also been reported. AIMS: The aim of this study was to evaluate the genetic relatedness between Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida krusei and Candida kefyr isolates recovered from intensive care unit (ICU) patients. METHODS: A total of 132 Candida clinical isolates (62 C. albicans, 40 C. glabrata, 13 C. tropicalis, 11 C. krusei, 6 C. kefyr), obtained from specimens of endotracheal aspirate, urine and blood taken from patients of a tertiary hospital in Poland, were included in the study. Species identification was performed by PCR method and genetic relatedness was assessed by randomly amplified polymorphic DNA assay (RAPD) with five primers. RESULTS: The RAPD analysis revealed high genetic diversity among the studied Candida isolates, indicating that most of the strains were from endogenous sources. Only two clonal strains of C. glabrata isolated from different patients were observed, suggesting a possible cross-transmission of these pathogens. CONCLUSIONS: Our study confirmed the high discriminatory power of the RAPD assay. This genotyping method can be applied to local epidemiological studies of Candida species.

Diagnóstico molecular, citogenético y anatomohistopatológico del Síndrome Freemartin en hembras bovinas en Colombia / Molecular, cytogenetic and anatomohistopatologic diagnostic of freemartin syndrome on females cattle in

El síndrome Freemartin es un estado de intersexualidad de muchas de las hembras bovinas provenientes de parto múltiple heterosexual (macho - hembra). Éste se origina en la vida fetal entre los 30 y 40 días de gestación producto del intercambio transplacentario de células mediante anastomosis vasculares, presentándose fenómenos de quimerismo 60XX/XY en varios tejidos, y esterilidad consecuente. En el presente trabajo se tomaron 106 muestras de sangre de terneras provenientes de parto múltiple heterosexual, se realizó extracción de ADN de leucocitos y se buscó la amplificación del gen SRY asociado al cromosoma "Y" mediante PCR y lectura en gel de agarosa. 90 terneras (84.9%) de las 106 amplificaron SRY, verificando el quimerismo 60XX/XY, y 16 terneras (15.1%) que no amplificaron el gen, libres del síndrome quimérico y por lo tanto, aptas reproductivamente. El análisis citogenético realizado mediante cultivo de linfocitos demostró la presencia del cromosoma "Y" en linfocitos de hembras positivas a SRY y la ausencia del quimerismo en hembras SRY negativas. El análisis anatómico post mortem de tractos reproductivos de hembras positivas a SRY detectó anormalidades características del síndrome tales como, clítoris hipertrofiados y atresias ductales cervicales. El análisis histopatológico de placas de gónadas de estos animales evidenció la presencia de ovotestículos. El presente estudio confirma la utilidad de las técnicas de biología molecular como herramientas diagnósticas del síndrome, para el aprovechamiento de hembras de reemplazo al servicio del hato bovino.

Freemartin syndrome is a intersexuality condition developed in many of the female calfs born from heterosexual multiple calvings (male female). This originates in the fetal development between 30 and 40 days of gestation with transplacental exchange of cells through vascular anastomosis, occurring 60XX/XY chimerism in various tissues, and consequent sterility. In this paper was took blood samples from 106 female calves born from a multiple heterosexual calving. DNA was extracted from leucocytes and searched the SRY gene amplification associated with the Y chromosome by PCR and reading in agarose gel. 90 of 106 samples (84.9%) was amplified the SRY gene, verifying the 60XX/XY chimerism, and 16 samples (15.1%) that did not amplify the gene. Cytogenetic analysis using lymphocytes cell cultures showed the presence of Y chromosome in samples positive for SRY and absence of chimerism in SRY negative samples. The postmortem analysis of female reproductive tracts of SRY positive calves, shows anatomical abnormalities such as clitoris hypertrophia and cervical atresia. Histological examination of gonads of these animals confirmed the presence of ovotestis. This study confirms the usefulness of molecular biology techniques as diagnostic tools of the syndrome, for the use of replacement females in cattle.