RESUMEN
Calreticulin is an endoplasmic reticulum protein important in cardiovascular development. Deletion of the calreticulin gene leads to defects in the heart and the formation of omphaloceal. These defects could both be due to changes in the extracellular matrix composition. Matrix metalloproteinases (MMP)-2 and MMP-9 are two of the MMPs which are essential for cardiovascular remodelling and development. Here, we tested the hypothesis that the defects observed in the heart and body wall of the calreticulin null embryos are due to alterations in MMP-2 and MMP-9 activity. Our results demonstrate that there is a significant decrease in the MMP-9 and increase in the MMP-2 activity and expression in the calreticulin deficient cells. We also showed that there is a significant increase in the expression level of membrane type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP). In contrast, there was no change in the tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP)-1 or -2 in the calreticulin deficient cells as compared to the wild type cells. Interestingly, the inhibition of the MEK kinase pathway using PD98059 attenuated the decrease in the MMP-9 mRNA with no effect on the MMP-2 mRNA level in the calreticulin deficient cells. Furthermore, PI3 kinase inhibitor decreased the expression of both the MMP-2 and MMP-9. This study is the first report on the role of calreticulin in regulating MMP activity.
Asunto(s)
Calreticulina/genética , Perfilación de la Expresión Génica , Metaloproteinasa 2 de la Matriz/genética , Metaloproteinasa 9 de la Matriz/genética , Androstadienos/farmacología , Animales , Western Blotting , Calreticulina/deficiencia , Línea Celular , Estructuras Embrionarias/citología , Estructuras Embrionarias/enzimología , Estructuras Embrionarias/metabolismo , Fibroblastos/efectos de los fármacos , Fibroblastos/enzimología , Fibroblastos/metabolismo , Flavonoides/farmacología , Regulación del Desarrollo de la Expresión Génica/efectos de los fármacos , Inmunohistoquímica , Insulina/farmacología , Metaloproteinasa 14 de la Matriz/genética , Metaloproteinasa 14 de la Matriz/metabolismo , Metaloproteinasa 2 de la Matriz/metabolismo , Metaloproteinasa 9 de la Matriz/metabolismo , Ratones , Ratones Noqueados , Inhibidores de las Quinasa Fosfoinosítidos-3 , Inhibidores de Proteínas Quinasas/farmacología , ARN Mensajero/genética , ARN Mensajero/metabolismo , Reacción en Cadena de la Polimerasa de Transcriptasa Inversa , Inhibidor Tisular de Metaloproteinasa-1/genética , Inhibidor Tisular de Metaloproteinasa-1/metabolismo , Inhibidor Tisular de Metaloproteinasa-2/genética , Inhibidor Tisular de Metaloproteinasa-2/metabolismo , WortmaninaRESUMEN
La relación estrógenos conjugados/no conjugados, asociada con procesos reproductivos, ha despertado el interés de estudiar el papel biológico y el control de la estrógeno sulfotransferasa y estrógeno sulfatasa que participan en la formación e hidrólisis de los estrógenos 3-sulfato, respectivamente. En este trabajo se determinó la actividad de las dos enzimas a través de la convesión recíproca de estrona sulfato-H3 y estrona-H3 en los sitios de implantación (SI) y áreas no implantadas (SNI) del útero de ratas durante el proceso de implantación embrionaria. En estos tejidos se observó un contraste en las actividades enzimáticas. En tanto que la sulfotransferasa en SI fue mayor que en SNI (0.205) pg vs. 0.144 pmola/mg proteína/h), la actividad de sulfatasa se presentó en forma inversa (1.470 y 1.977 pmolas/ mg proteína/h respectivamente). Estos resultados indican la presencia simultánea de ambas anzimas en el útero de rata y sugieren la existencia en SI de un mecanismo que regula la concentración local de estrógenos libres y sulfoconjugados en el que participan dichas enzimas
Asunto(s)
Blastocisto/fisiología , Estructuras Embrionarias/enzimología , Desarrollo Embrionario , Estradiol/biosíntesis , Estrógenos/fisiología , Proteínas Recombinantes/biosíntesis , Receptores de Estradiol/fisiología , Sulfatasas/fisiología , Sulfotransferasas/fisiologíaRESUMEN
A new enzymatic assay for the determination of alkaline phosphatase (APase) activity in preimplantation mouse concepti is described. This method allows estimation of APase activity of concepti extracts using the fluorogenic substrate, 3,6-fluorescein diphosphate (FDP). For measuring APase activity, 0.1 percent Nonidet P-40 was used to solubilize the enzyme. Control assays showed that this procedure does not modify the enzyme activity. According to the Km obtained for APase from mouse concepti (between 1-2 microM), the initial concentration of FDP was 20 microM, which is 10 fold the Km. The assay sensitivity allows continuous recording of the product generated and a reliable determination in less than 20 min. Results show that APase activity in mouse concepti may be detected from the 2-cell stage, increasing exponentially towards the blastocyst stage