Specific amplification of rearranged immunoglobulin variable region genes from mouse hybridoma cells.

In this article we show how the polymerase chain reaction (PCR) and primers designed for conserved sequences of leader (L), framework one (FR1) and constant (CONST) regions of immunoglobulin light and heavy chain genes can be used for the cloning and sequencing of rearranged antibody variable regions from mouse hybridoma cells. RNA was extracted from the mouse hybridoma cells secreting MAbs: IOR-T3a (anti-CD3), C6 (anti-P1 of N. meningitidis B385), IOR-T1 (anti-CD6), CB-CEA.1 (anti-carcinoembryonic antigen), and CB-Fib.1 (anti-human fibrin). First strand cDNA was synthesized and amplified using PCR. The newly designed primers are superior to others reported recently in the literature. Isolated PCR DNA fragments of C6 and IOR-T3a were sequenced after asymmetric amplification, or M13 cloning. The FR1/CONST primer combinations selectively amplified mouse lights chain of groups kappa II, V, and VI, and heavy chains of groups IIa and IIc. The L/CONST primers for light chains amplified light chains from all four hybridomas. These methods greatly facilitate structural and functional studies of antibodies by reducing the efforts required to clone and sequence their variable regions.

Inmunización primaria in vitro de linfocitos de ratón para la obtención de hibridomas B / In vitro primary immunization of mouse lymphocytes for the obtention of B hybridomas

Las células esplénicas de ratones BALB/c se sometieron a un proceso de inmunización primaria en cultivo, empleando como antígeno el factor de crecimiento epidérmico humano recombinante, y el sobrenadante de cultivos mixtos de timocitos de ratón como fuente estimuladora de activación y progresión. En algunos experimentos se evaluó el efecto del sobrenadante de células endoteliales humanas (HECS) durante el período de inmunización. Las células inmunizadas se hibridizaron con el mieloma P3/x63-Ag8-653 para obtener hibridomas. Por microscopía electrónica de trasmisión se siguieron los cambios morfológicos de los linfocitos durante los cinco días de inmunización in vitro, siendo estos característicos de la transformación de células quiescentes en altamente secretoras. Se demostró que la secreción de anticuerpo específico durante el período de inmunización no podía ser evaluada mediante un sistema ELISA con el antígeno, a causa de la gran reactividad cruzada inespecífica de IgM policlonales. El HECS estimuló, tanto la frecuencia de hibridización como la formación de hibridomas específicos. Se incluyó una batería de antígenos no relacionados durante el ensayo de los sobrenadantes de los hibridomas, con vistas a descartar las células secretoras de IgM de amplia reactividad cruzada. Todos los hibridomas específicos producían anticuerpos del tipo IgM.

Evaluación de diferentes condiciones de cultivo del hibridoma IFI/B6/C5 para su propagación in vitro y la producción de anticuerpos monoclonales / Evaluation of different culture conditions for the in vitro propagation of the hybridoma IFI/B6/C5, and the production of monoclonal antibodies

Las cantidades y la pureza requeridas para los anticuerpos monoclonales (AvM), con vistas a satisfacer su demanda mundial, han conducido al desarrollo de las técnicas para la propagación masiva in vitro de los hibridomas, y su purificación a partir de los sobrenadantes de cultivo, como una alternativa ventajosa con respecto a su producción convencional en animales. Como paso previo para abordar el cultivo masivo, nosotros hemos estudiado el crecimiento y producción de inmunoglobulinas del hibridoma IFI/B6/C5, secretor de AcM contra el IFN * humano recombinante, bajo diferentes condiciones de cultivo y en distintas formulaciones de medio. Se demostró que la combinación: 2% de suero bovino y 3% de sobrenadante de células endoteliales humanas (HECS), como aditivo al medio base RPMI1640 suplementado, es comparable, e incluso mejor, que el 10% de suero bovino, la mezcla insulina-transferrina-etanolamina-selenio (ITES), y 2% de suero bovino más ITES, tanto para el crecimiento estacionario, como en botellas roller, y la producción de inmunoglobulinas monoclonales. Por otra parte, se demostró que los cultivos roller, sometidos a un sistema de renovación parcial del medio, con reposición celular, permiten alcanzar densidades celulares superiores, y concentraciones mayores de inmunoglobulinas.

Obtención de hibridomas de ratón productores de anticuerpos monoclonales que reconocen células humanas de origen T, III:Determinación del reconocimiento ultraestructural de los anticuerpos monoclonales IOR-T1 e IOR-T2 / Obtention of mice hybridomas producing monoclonal antibodies which recognize human T cell: determination of ultrastructural recognition of IOR-T1 and IOR-T2 monoclonal antibodies

La combinación de métodos inmunológicos y ultraestructurales constituye un elemento fundamental para la identificación de las características del reconocimiento celular de los anticuerpos monoclonales. En el presente artículo se reporta la aplicación de la técnica de inmunoperoxidasa para microscopia electrónica, en la dilucidación del reconocimiento celular y la ubicación de las estructuras antigénicas identificadas por los anticuerpos monoclonales IOR-T1 e IOR-T2, utilizando como sustrato antigénico células mononucleares de sangre periférica de individuos normales y de pacientes con linfomas T cutáneos. Se determinó que el IOR-T1 reconoce un marcador de superficie celular característicos de los linfocito humanos T normales, que puede ser expresado también por células tumorales del mismo origen. El IOR-T2 identifica exclusivamente una parte de la población tumoral celular con características morfológicas compatibles con las células de Sézary, provenientes de la sangre periférica de dos pacientes con linfomas T cutáneos