Practical reversed-phase high-performance liquid chromatography method for laboratory-scale purification of recombinant human thyrotropin.

A small, semi-preparative C(4) RP-HPLC column was used to set up the conclusive laboratory-scale purification of Chinese hamster ovary-derived human thyrotropin (hTSH), after a preliminary concentration-purification of an extremely dilute and poorly ( approximately 0.6 microg hTSH/mL; mass fraction=0.35%) conditioned medium on a cation exchanger. Several fractions of this eluate were repeatedly injected on the semi-preparative column, obtaining, in a single run (<1h chromatographic time), a concentrated pool ( approximately 1.2 mg/mL) of highly purified hTSH that could be further concentrated to >3 mg/mL and then efficiently lyophilized. The overall recovery in the rapid RP-HPLC purification step, including concentration and lyophilization, was of the order of 80%. The final product, when tested via a precise, single-dose in vivo bioassay, confirmed that it did not suffer any loss of bioactivity. This same methodology can be easily adapted to the small-scale purification of other recombinant products, even when obtained from genetically modified organisms at extremely low concentrations and mass fractions.

Two-step chromatographic purification of recombinant human thyrotrophin and its immunological, biological, physico-chemical and mass spectral characterization.

A purification strategy for rapidly obtaining recombinant human thyrotropin (rhTSH) was designed based on size exclusion and reversed-phase high-performance liquid chromatographic (HPLC) analysis, carried out on hTSH-secreting CHO cell conditioned medium. These analyses permitted the identification of the main contaminants to be eliminated. Considering that hTSH is highly hydrophobic and elutes only with the addition of organic solvents, hydrophobic interaction chromatography was adopted as the first purification step; this resulted in the elimination of, among others, the major contaminant. A second purification step, based on size exclusion chromatography, was then utilized, being effective in the elimination of other previously identified contaminating proteins. Useful purity, as high as 99% at the chemical reagent level, and recoveries (37%) were obtained by adopting this two step strategy, which also provided adequate material for physico-chemical, immunological and biological characterization. This included matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectral analysis (MALDI-TOF-MS), Western blotting analysis, in vivo biological assay, size-exclusion HPLC (HPSEC) and reversed-phase HPLC (RP-HPLC) analysis, which confirmed the integrity and bioactivity of our rhTSH in comparison with the only two reference preparations available at the milligram level of native (hTSH-NIDDK) and recombinant (Thyrogen) hTSH. Thyrogen and rhTSH-IPEN, when compared to pit-hTSH-NIDDK, presented more than twice as much biological activity and about 7% increased molecular mass by MALDI-TOF-MS analysis, an accurate heterodimer mass determination providing the Mr values of 29,611, 29,839 and 27,829, respectively. The increased molecular mass of the two recombinant preparations was also confirmed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and HPSEC analysis. Comparing the two recombinant preparations, minor though interesting physico-chemical and biological differences were also observed.

Hormona estimulante de la tiroides

La hormona estimulante de la tiroides- TSH por throid stimulating hormone-, liberada por la hipófisis anterior, es principal regulador de la función tiroidea. La secreción de la TSH es controlada por el hipotálmo mediante la hormona liberadora de tirotropina - TRH por thyrotropin releasing hormone-. A su vez, este sistemea regula la liberación de las hormonas tiroides: Tiroxina- T4- y tirotropina- T3-. En la producción de la TSH existe un mecanismo de retroalimentación negativo, que es sensible a las concentraciones de las hormonas tiroideas circulantes, T3 y T4, controladas por el hipotálamo. Colectivamente este sistema se denomina eje hipotálamo-hipofisiario-tiroideo. Cualquier alteraciónen la función del eje influye sobre los niveles sanguíneos de la T4 y T3.

Pesquisa neonatal de hipotiroidismo congénito (HC) : experiencia en sangre de cordón / Neonatal search of congenital hypothyroidism (CH) : experience in blood cord

Introducción: La imposibilidad de llevar a cabo la pesquisa de hipotiroidismo congénito en el momento del alta de la maternidad llevo a implementar la pesquisa en sangre de cordón a fin de prevenir la discapacidad mental que esta enfermedad produce de no diagnosticarse y tratarse adecuadamente en forma precoz. Objetivo: El objetivo de este trabajo es relatar la experiencia en la pesquisa neonatal de hipotiroidismo congénito (HC) realizada en sangre de cordón implementada en la Maternidad Sardá desde el 1/10/1991 hasta el 31/3/1995. Población y métodos: Se estudiaron 22.384 recién nacidos (82.6 por ciento de término y 17.4 por ciento prematuros). TSH se determinó por métodos inmunoradiométrico (IRMA) e inmunofluorométrico (IFMA) en sangre seca en papel de filtro obtenida de cordón umbilical. Resultados: Se detectaron 6 HC permanentes y 2 transitorios. Incidencia 1:3.790 y 1:11.192 respectivamente. La cobertura, de 80 por ciento en un comienzo alcanzó el 99.5 por ciento en 1995. La edad de confirmación diagnóstica y tratamiento fue de 19ñ5 días (XñDS). El tiempo de ubicación varió entre 1 y 14 días y fue el factor negativo en la implementación del programa. Todos los niños fueron seguidos y maduran normalmente. Conclusión: La pesquisa de HC en sangre de cordón, en el contexto de un programa de pesquisa, constituye una alternativa válida de diagnóstico para esta enfermedad inaparente en el momento del nacimiento.

Pesquisa neonatal de hipotiroidismo congénito (HC) : experiencia en sangre de cordón / Neonatal search of congenital hypothyroidism (CH) : experience in blood cord

Introducción: La imposibilidad de llevar a cabo la pesquisa de hipotiroidismo congénito en el momento del alta de la maternidad llevo a implementar la pesquisa en sangre de cordón a fin de prevenir la discapacidad mental que esta enfermedad produce de no diagnosticarse y tratarse adecuadamente en forma precoz. Objetivo: El objetivo de este trabajo es relatar la experiencia en la pesquisa neonatal de hipotiroidismo congénito (HC) realizada en sangre de cordón implementada en la Maternidad Sardá desde el 1/10/1991 hasta el 31/3/1995. Población y métodos: Se estudiaron 22.384 recién nacidos (82.6 por ciento de término y 17.4 por ciento prematuros). TSH se determinó por métodos inmunoradiométrico (IRMA) e inmunofluorométrico (IFMA) en sangre seca en papel de filtro obtenida de cordón umbilical. Resultados: Se detectaron 6 HC permanentes y 2 transitorios. Incidencia 1:3.790 y 1:11.192 respectivamente. La cobertura, de 80 por ciento en un comienzo alcanzó el 99.5 por ciento en 1995. La edad de confirmación diagnóstica y tratamiento fue de 19ñ5 días (XñDS). El tiempo de ubicación varió entre 1 y 14 días y fue el factor negativo en la implementación del programa. Todos los niños fueron seguidos y maduran normalmente. Conclusión: La pesquisa de HC en sangre de cordón, en el contexto de un programa de pesquisa, constituye una alternativa válida de diagnóstico para esta enfermedad inaparente en el momento del nacimiento. (AU)

Efecto de matrices comunes para ensayos estandares sobre la performance de métodos inmunométricos ultrasensibles para TSH / Effect of commor matrix for standart assay on the performance of method inmunometric ultrasensible for TSH

Este documento describe los resultados de un estudio en colaboración organizado por un grupo de trabajo conjunto de la IFCC y la OMS (WHO) y que comprende nueve fabricantes de equipos para ensayos inmunométricos de TSH.El estudio fue diseñado para determinar si un calibrador con una matriz común da mejor concordancia entre los laboratorios para la calibración de muestras de suero, que varios equipos calibradores y para evaluar varios materiales y determinar la posibilidad de ser usadosa como matrices comunes. Los equipos calibradores que constan de IRP para TSH realizados en dos matrices comunes, 1)suero de pacientes con tirotoxicosis no tratadas o 2) suero de personas tratadas con dosis supresoras de trydotironina, dieron resultado similares para la variación interlaboratorio de estimaciones de concentracin de TSH para un rango de muestras de suero. Las curvas dosis-respuesta para los dos calibrantesa en matrices "comunes" fueron similares entre sí y con las de equipos calibrantes. Sin embargo, la ocurrencia de efectos séricos no específicos se muestra en la comparación de estos calibrantes con los resultados para calibrantes hechos con una tercera matriz común, suero tratado con lecitina de germen de trigo. Las curvas dosis respuesta para ese calibrante fueron distintas de las de los otros y la variación entre laboratorios para las estimaciones en términos de este último calibrante mostró un aumento sustancial. Además, aunque las variaciones entre laboratorios para las estimaciones de la concentración de TSH, en términos de cada uno de estos calibrantes (excepto aquellos hechos en suero tratado con lecitina de germen de trigo), fueron similares para cualquier muestra de cinco pacientes hipertiroideos, las variaciones no fueron uniformes entre muestras,aun para muestras con concentraciones medias de TSH similares. Estos resultadosa sugieren que un factor importante en la variación entre laboratorios, especialmente en la región cercana a la "dosis cero", está relacionado con la muestra, y es causado por muestras particulares que interactúan en distinta forma con diferentes sistemas de ensayo. En general,parece que para los bien controlados equipos de ensayos inmunométricos "ultra sensibles" de TSH, incluídos en este estudio, la concordancia entre laboratorios de las estimaciones de la concentración de TYSH en muestras de suero,no es probable que sea mejorada por el uso de una matriz común para estos estándares

Efecto de matrices comunes para ensayos estandares sobre la performance de métodos inmunométricos ultrasensibles para TSH / Effect of commor matrix for standart assay on the performance of method inmunometric ultrasensible for TSH

Este documento describe los resultados de un estudio en colaboración organizado por un grupo de trabajo conjunto de la IFCC y la OMS (WHO) y que comprende nueve fabricantes de equipos para ensayos inmunométricos de TSH.El estudio fue diseñado para determinar si un calibrador con una matriz común da mejor concordancia entre los laboratorios para la calibración de muestras de suero, que varios equipos calibradores y para evaluar varios materiales y determinar la posibilidad de ser usadosa como matrices comunes. Los equipos calibradores que constan de IRP para TSH realizados en dos matrices comunes, 1)suero de pacientes con tirotoxicosis no tratadas o 2) suero de personas tratadas con dosis supresoras de trydotironina, dieron resultado similares para la variación interlaboratorio de estimaciones de concentracin de TSH para un rango de muestras de suero. Las curvas dosis-respuesta para los dos calibrantesa en matrices "comunes" fueron similares entre sí y con las de equipos calibrantes. Sin embargo, la ocurrencia de efectos séricos no específicos se muestra en la comparación de estos calibrantes con los resultados para calibrantes hechos con una tercera matriz común, suero tratado con lecitina de germen de trigo. Las curvas dosis respuesta para ese calibrante fueron distintas de las de los otros y la variación entre laboratorios para las estimaciones en términos de este último calibrante mostró un aumento sustancial. Además, aunque las variaciones entre laboratorios para las estimaciones de la concentración de TSH, en términos de cada uno de estos calibrantes (excepto aquellos hechos en suero tratado con lecitina de germen de trigo), fueron similares para cualquier muestra de cinco pacientes hipertiroideos, las variaciones no fueron uniformes entre muestras,aun para muestras con concentraciones medias de TSH similares. Estos resultadosa sugieren que un factor importante en la variación entre laboratorios, especialmente en la región cercana a la "dosis cero", está relacionado con la muestra, y es causado por muestras particulares que interactúan en distinta forma con diferentes sistemas de ensayo. En general,parece que para los bien controlados equipos de ensayos inmunométricos "ultra sensibles" de TSH, incluídos en este estudio, la concordancia entre laboratorios de las estimaciones de la concentración de TYSH en muestras de suero,no es probable que sea mejorada por el uso de una matriz común para estos estándares

Human pituitary hormones extraction.

In order to know the efficiency of the human pituitary hormone extraction method utilized in the laboratory, six batches of 100 pituitaries each, were collected in acetone. Its delipidization and the initial acid extraction (0.3 M KCl, pH 5.5) of the powder were performed in the presence of 0.1 per cent thioethanol and the extraction was completed with an alkaline solution (0.1 N NaOH + H2O, v/v, pH 10.5). Hields in weight of powder and protein concentration for each fraction were similar to those previously reported by Elrick. Characterization of fractions with disc-gel-electrophoresis demonstrated a reproducible pattern for GH, and some differences among the samples containing the glycoproteins. The hormonal activities determined by radioimmunoassay showed a low contamination of GH in the fractions rich in glycoproteins, but these latter were similarly distributed between the acid and the alkaline extracts. The glycoprotein fraction had an important activity of TSH. The hormonal content per pituitary was calculated from the addition of activities in both extracts and the last residue; GH = 3 mg (4.494 IU); FSH = 761 micrograms (13.410 IU); LH = 782 micrograms (46.920 IU); TSH = 2.939 mg (9.350 IU). It is concluded that the technique is useful since there was a low GH contamination in the glycoprotein fraction and the TSH yield was important.