Comparing the long-term persistence of different Wolbachia strains after the release of bacteria-carrying mosquitoes.

This paper proposes a bidimensional modeling framework for Wolbachia invasion, assuming imperfect maternal transmission, incomplete cytoplasmic incompatibility, and direct infection loss due to thermal stress. Our model adapts to various Wolbachia strains and retains all properties of higher-dimensional models. The conditions for the durable coexistence of Wolbachia-carrying and wild mosquitoes are expressed using the model's parameters in a compact closed form. When the Wolbachia bacterium is locally established, the size of the remanent wild population can be assessed by a direct formula derived from the model. The model was tested for four Wolbachia strains undergoing laboratory and field trials to control mosquito-borne diseases: wMel, wMelPop, wAlbB, and wAu. As all these bacterial strains affect the individual fitness of mosquito hosts differently and exhibit different levels of resistance to temperature variations, the model helped to conclude that: (1) the wMel strain spreads faster in wild mosquito populations; (2) the wMelPop exhibits lower resilience but also guarantees the smallest size of the remanent wild population; (3) the wAlbB strain performs better at higher ambient temperatures than others; (4) the wAu strain is not sustainable and cannot persist in the wild mosquito population despite its resistance to high temperatures.

Backward Bifurcation as a Desirable Phenomenon: Increased Fecundity Through Infection.

Backward or subcritical bifurcation is usually considered an undesirable phenomenon in epidemiology since control measures require a reduction in R0 not below one but below a much smaller value. However, there are contexts for which a backward or subcritical bifurcation is not a bad thing; it can even be desirable. Such is the case for any characteristic that can be passed to the next generation (genetically fixed or not) and that increases the effective reproductive rate of the host or the total number of individuals. In the present work, we study an epidemiological model consisting of two classes, susceptible and "infected" individuals; the model considers a characteristic that is passed from "infected" to "susceptible" by direct "contact," for instance increased fecundity. We analyze conditions for the appearance of a backward or subcritical bifurcation. We discuss the advantage for the population under infection, since the total number of individuals increases at equilibrium. If one takes that as a proxy for increased fitness, it would increase the species' ecological success. One key element in the model is the fact that "susceptible" individuals have "susceptible" descendants, but "infected" individuals can have "infected" descendants as well as "susceptible" ones. A somehow rare addition for epidemiological models, the fact that "infected" individuals reproduce more rapidly than the susceptible ones, leads to unexpected consequences. Facilitating the "inoculation" increases the total population size, i.e., the backward or subcritical bifurcation appears, with desirable consequences for the population. We show that an increase in the number of susceptible newborns is the main reason for the appearance of a backward or subcritical bifurcation, which induces a bigger population size. We analyze the effect of different combinations of susceptible/infected birth rates. This kind of phenomenon has been observed for bacterial infections in several insects-bacteria and nematodes-bacteria interactions; in particular, it has been intensely studied in interactions of wasps and flies with the genus Wolbachia. It has also been shown in amphibians.

Wolbachia significantly impacts the vector competence of Aedes aegypti for Mayaro virus.

Wolbachia, an intracellular endosymbiont present in up to 70% of all insect species, has been suggested as a sustainable strategy for the control of arboviruses such as Dengue, Zika and Chikungunya. As Mayaro virus outbreaks have also been reported in Latin American countries, the objective of this study was to evaluate the vector competence of Brazilian field-collected Ae. aegypti and the impact of Wolbachia (wMel strain) upon this virus. Our in vitro studies with Aag2 cells showed that Mayaro virus can rapidly multiply, whereas in wMel-infected Aag2 cells, viral growth was significantly impaired. In addition, C6/36 cells seem to have alterations when infected by Mayaro virus. In vivo experiments showed that field-collected Ae. aegypti mosquitoes are highly permissive to Mayaro virus infection, and high viral prevalence was observed in the saliva. On the other hand, Wolbachia-harboring mosquitoes showed significantly impaired capability to transmit Mayaro virus. Our results suggest that the use of Wolbachia-harboring mosquitoes may represent an effective mechanism for the reduction of Mayaro virus transmission throughout Latin America.

Biological characterization of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) in Argentina: implications for arbovirus transmission.

Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) is an invasive mosquito, native to Asia, that has expanded its range worldwide. It is considered to be a public health threat as it is a competent vector of viruses of medical importance, including dengue, chikungunya, and Zika. Despite its medical importance there is almost no information on biologically important traits of Ae. albopictus in Argentina. We studied life cycle traits, demographic parameters and analyzed the competence of this mosquito as a virus vector. In addition, we determined the prevalence of Wolbachia strains in Ae. albopictus as a first approach to investigate the potential role of this bacteria in modulating vector competence for arboviruses. We observed low hatch rates of eggs, which led to a negative growth rate. We found that Ae. albopictus individuals were infected with Wolbachia in the F1 but while standard superinfection with wAlbA and wAlbB types was found in 66.7% of the females, 16.7% of the females and 62.5% of the males were single-infected with the wAlbB strain. Finally, despite high levels of infection and dissemination, particularly for chikungunya virus, Ae. albopictus from subtropical Argentina were found to be relatively inefficient vectors for transmission of both chikungunya and dengue viruses.

Optimal control approach for establishing wMelPop Wolbachia infection among wild Aedes aegypti populations.

Wolbachia-based biocontrol has recently emerged as a potential method for prevention and control of dengue and other vector-borne diseases. Major vector species, such as Aedes aegypti females, when deliberately infected with Wolbachia become less capable of getting viral infections and transmitting the virus to human hosts. In this paper, we propose an explicit sex-structured population model that describes an interaction of uninfected (wild) male and female mosquitoes and those deliberately infected with wMelPop strain of Wolbachia in the same locality. This particular strain of Wolbachia is regarded as the best blocker of dengue and other arboviral infections. However, wMelPop strain of Wolbachia also causes the loss of individual fitness in Aedes aegypti mosquitoes. Our model allows for natural introduction of the decision (or control) variable, and we apply the optimal control approach to simulate wMelPop Wolbachia infestation of wild Aedes aegypti populations. The control action consists in continuous periodic releases of mosquitoes previously infected with wMelPop strain of Wolbachia in laboratory conditions. The ultimate purpose of control is to find a tradeoff between reaching the population replacement in minimum time and with minimum cost of the control effort. This approach also allows us to estimate the number of Wolbachia-carrying mosquitoes to be released in day-by-day control action. The proposed method of biological control is safe to human health, does not contaminate the environment, does not make harm to non-target species, and preserves their interaction with mosquitoes in the ecosystem.

Ensuring successful introduction of Wolbachia in natural populations of Aedes aegypti by means of feedback control.

The control of the spread of dengue fever by introduction of the intracellular parasitic bacterium Wolbachia in populations of the vector Aedes aegypti, is presently one of the most promising tools for eliminating dengue, in the absence of an efficient vaccine. The success of this operation requires locally careful planning to determine the adequate number of individuals carrying the Wolbachia parasite that need to be introduced into the natural population. The introduced mosquitoes are expected to eventually replace the Wolbachia-free population and guarantee permanent protection against the transmission of dengue to human. In this study, we propose and analyze a model describing the fundamental aspects of the competition between mosquitoes carrying Wolbachia and mosquitoes free of the parasite. We then use feedback control techniques to devise an introduction protocol that is proved to guarantee that the population converges to a stable equilibrium where the totality of mosquitoes carry Wolbachia.

Wolbachia and dengue virus infection in the mosquito Aedes fluviatilis (Diptera: Culicidae).

Dengue represents a serious threat to human health, with billions of people living at risk of the disease. Wolbachia pipientis is a bacterial endosymbiont common to many insect species. Wolbachia transinfections in mosquito disease vectors have great value for disease control given the bacterium's ability to spread into wild mosquito populations, and to interfere with infections of pathogens, such as dengue virus. Aedes fluviatilis is a mosquito with a widespread distribution in Latin America, but its status as a dengue vector has not been clarified. Ae. fluviatilis is also naturally infected by the wFlu Wolbachia strain, which has been demonstrated to enhance infection with the avian malarial parasite Plasmodium gallinaceum. We performed experimental infections of Ae. fluviatilis with DENV-2 and DENV-3 isolates from Brazil via injection or oral feeding to provide insight into its competence for the virus. We also examined the effect of the native Wolbachia infection on the virus using a mosquito line where the wFlu infection had been cleared by antibiotic treatment. Through RT-qPCR, we observed that Ae. fluviatilis could become infected with both viruses via either method of infection, although at a lower rate than Aedes aegypti, the primary dengue vector. We then detected DENV-2 and DENV-3 in the saliva of injected mosquitoes, and observed that injection of DENV-3-infected saliva produced subsequent infections in naïve Ae. aegypti. However, across our data we observed no difference in prevalence of infection and viral load between Wolbachia-infected and -uninfected mosquitoes, suggesting that there is no effect of wFlu on dengue virus. Our results highlight that Ae. fluviatilis could potentially serve as a dengue vector under the right circumstances, although further testing is required to determine if this occurs in the field.

Wolbachia Infections Responsible for Thelytoky in Dryinid Wasps. The Case of Gonatopus bonaerensis Virla (Hymenoptera: Dryinidae).

We studied the occurrence of Wolbachia in the parasitoid Gonatopus bonaerensis Virla (Hymenoptera: Dryinidae). In order to verify the existence of natural infections in the parasitoid, a field survey was conducted. Identification of Wolbachia was performed on the basis of 16S rDNA, wsp_F1, and wsp_R1-sequences. After the detection of the bacteria, infected specimens of G. bonaerensis were treated with a solution of tetracycline. In Tucumán, parasitoids hold Wolbachia endosymbiont, which seems to control the wasp's reproduction in the nature turning it into thelytokous. The symbiont was identified as the Wolbachia sp. wRi strain. The cure of infected unfertilized females determined the normal arrhenotokous parthenogenesis and the production of male offspring. As a consequence of this procedure, the male of G. bonaerensis is described for the first time.

Capacidade de bloqueio a patógenos de cepas de Wolbachia em Aedes sp

A bactéria Wolbachia pipientis tem sido investigada como nova estratégia de controle biológico que pode ser usada simultaneamente com as medidas de controle de vetores já existentes. O potencial desse endossimbionte para o controle de doenças trasnmitidas por vetores está na sua capacidade de induzir diversos efeitos no hospedeiro, dentre eles a capacidade de bloquear patógenos. Nos dias de hoje existem técnicas de transinfecção que permitem criar associações entre Wolbachia e hospedeiros que não abrigam a bactéria naturalmente. Estudos anteriores têm demonstrado que nesses casos o fenótipo de bloqueio é mais intenso em comparação àquele observado em mosquitos com infecção natural. As infecções nativas podem se atenuar depois de um processo de coevolução entre o hospedeiro e o endossimbionte, entretanto, sob condições específicas, possivelmente seja observada uma capacidade residual de interferência a patógenos. Uma dessas circunstâncias pode ser a carga parasitária adquirida pelo vetor em uma alimentação sanguínea. Diante do exposto, realizamos uma análise comparativa entre a capacidade de bloqueio em duas espécies de Aedes infectados com Wolbachia, o mosquito Aedes fluviatilis com a cepa natural wFlu, e o Aedes aegypti transinfectado com a cepa wMel. Mosquitos tratados com tetraciclina foram usadas como controle para cada espécie. Investigamos a capacidade de bloqueio para o Dengue vírus e para o modelo de malária aviária Plasmodium gallinaceum.

Os mosquitos foram infectados diretamente em aves com curvas ascendentes de parasitemias ou via alimentação sanguínea artificial e os intestinos foram dissecados 7 dias após infecção para contagem de oocistos. Em outra série de experimentos vírus dengue sorotipo 3 foi adicionado a sangue humano para obter titulações que variaram de 106 a 103 PFU/mLe as cargas virais foram quantificadas aos 7 e 14 dias pós infecção sanguínea por RT-qPCR.

Em contraste ao que foi observado para o P. gallinaceum,observamos diferentes respostas ao virus nas duas espécies de Aedes, a cepa wMel induziu forte interferencia a este patógeno enquanto que wFlu levou ao aumento da susceptibilidade no Ae. fluviatilis aos 7 dias pós infecção. Diante desses resultados investigamos a presença do vírus na saliva de Ae. fluviatilis. Mais uma vez foi observado aumento da susceptibilidade dos mosquitos da linhagem wFlu e detectamos a presença do virus em parte das salivas coletadas. Nossos dados sugerem que a cepa wMel não é eficiente no bloqueio do P. gallinaceum, o que indica que a capacidade de interferencia não é uma característica universal para os diferentes patógenos. Constatamos que a carga parasitária não é um fator que induz a capacidade de bloqueio em Ae fluviatilis, já que esse feito não foi observado em nenhuma das parasitemias testadas. Criticamente, demonstramos o potencial aumento da susceptibilidade de Ae. fluviatilis ao vírus dengue em uma infecção nativa de Wolbachia. Nossos resultados destacaram que a análise da capacidade de bloqueio a patógenos em mosquitos transinfectados com Wolbachia é complexa e que o estudo de espécies correlatas naturalmente infectadas por este endossimbionte podem ajudar a esclarecer questões relacionadas com o fenótipo de bloqueio de infecção a patógenos.

Avaliação da influência da Wolbachia na infecção e transmissão vertical do vírus dengue em mosquitos Aedes aegypti

A dengue é um problema médico crescente em países subtropicais e tropicais. A dengue é uma infecção viral que apresentem quatro sorotipos distintos, DENV-1 a -4, sendo recentemente relatado o quinto sorotipo, DENV-5, na Malásia. Estes são transmitidos pela picada de mosquitos infectados do gênero Aedes, sendo o Aedes aegypti o principal vetor. Atualmente, a prevenção e controle da dengue dependem exclusivamente de medidas de combate ao vetor, e estas apresentam-se ineficientes, principalmente em países em desenvolvimento. Nesse contexto, há a necessidade da busca de novas estratégias que possam ser utilizadas concomitantemente com as formas de controle já existentes. A Wolbachia é uma bactéria intracelular, amplamente conhecida por promover o fenótipo de bloqueio do vírus dengue em mosquitos A. aegypti. Apesar disto, não se conhece se a Wolbachia é capaz de interferir na infecção da progênie de mosquitos infectados com o vírus dengue, fenômeno conhecido como transmissão vertical. A transmissão vertical pode estar associada com a manutenção do vírus em períodos inter-epidêmicos ou em locais nos quais a transmissão ativa está diminuída.

Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a Wolbachia introduzida na linhagem brasileira de A. aegypti influencia a transmissão vertical da dengue. Duas metodologias de infecção foram utilizadas: infecção oral e nanoinjeção intratorácica, onde utilizou-se o DENV-4 e DENV-1,-3 e -4, respectivamente. Para estes experimentos, foram comparados mosquitos com Wolbachia (Mel) e uma linhagem de mosquitos tratada com antibiótico e portanto, livre da bactéria (Tet). Os ovos dos mosquitos infectados foram coletados em um período de 20 e 11 dias após a infecção, oral e injeções, respectivamente. A fecundidade e fertilidade, de forma geral, foram diminuídas na co-infecção da Wolbachia com o vírus dengue. Em todos os mosquitos infectados, não se observou diferenças na suscetibilidade ao vírus, porém a carga viral foi diminuída pela Wolbachia no DENV-4, em ambas as formas de infecção.

Foi possível a detecção de pools positivos independente da forma de infecção, demonstrando que a transmissão vertical do vírus dengue ocorreu, porém a proporção de pools positivos entre os grupos Mel e Tet não foi alterada. Entretanto, pudemos observar uma diminuição da carga viral nos pools positivos Mel. Os ovários na infecção oral, interessantemente, tiveram uma forte diminuição da suscetibilidade conferida pela Wolbachia. A carga viral dos ovários foi diminuída em DENV-1 e DENV-4, em ambas as formas de infecção. Os dados obtidos nestes experimentos apontam que a transmissão vertical do vírus dengue ocorreu em pequenas taxas. Independente da forma de infecção utilizada, as taxas não variaram, mostrando que os mecanismos que regulam a ocorrência da transmissão vertical precisam ser explorados. Concluímos que, a Wolbachia pode potencialmente ser responsável pela redução da transmissão vertical em campo. Isto é considerado um grande avanço no controle da dengue, se realmente for comprovada que a transmissão vertical é a responsável pela manutenção do vírus em períodos inter-epidêmicos.

Avaliação da influência da Wolbachia na infecção e transmissão vertical do vírus dengue em mosquitos Aedes aegypti / Evaluation of the influence of the Wolbachia infection and vertical transmission of dengue virus in Aedes aegypti mosquitoes

A dengue é um problema médico crescente em países subtropicais e tropicais. A dengue é uma infecção viral que apresentem quatro sorotipos distintos, DENV-1 a -4, sendo recentemente relatado o quinto sorotipo, DENV-5, na Malásia. Estes são transmitidos pela picada de mosquitos infectados do gênero Aedes, sendo o Aedes aegypti o principal vetor. Atualmente, a prevenção e controle da dengue dependem exclusivamente de medidas de combate ao vetor, e estas apresentam-se ineficientes, principalmente em países em desenvolvimento. Nesse contexto, há a necessidade da busca de novas estratégias que possam ser utilizadas concomitantemente com as formas de controle já existentes. A Wolbachia é uma bactéria intracelular, amplamente conhecida por promover o fenótipo de bloqueio do vírus dengue em mosquitos A. aegypti. Apesar disto, não se conhece se a Wolbachia é capaz de interferir na infecção da progênie de mosquitos infectados com o vírus dengue, fenômeno conhecido como transmissão vertical. A transmissão vertical pode estar associada com a manutenção do vírus em períodos inter-epidêmicos ou em locais nos quais a transmissão ativa está diminuída.

Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a Wolbachia introduzida na linhagem brasileira de A. aegypti influencia a transmissão vertical da dengue. Duas metodologias de infecção foram utilizadas: infecção oral e nanoinjeção intratorácica, onde utilizou-se o DENV-4 e DENV-1,-3 e -4, respectivamente. Para estes experimentos, foram comparados mosquitos com Wolbachia (Mel) e uma linhagem de mosquitos tratada com antibiótico e portanto, livre da bactéria (Tet). Os ovos dos mosquitos infectados foram coletados em um período de 20 e 11 dias após a infecção, oral e injeções, respectivamente. A fecundidade e fertilidade, de forma geral, foram diminuídas na co-infecção da Wolbachia com o vírus dengue. Em todos os mosquitos infectados, não se observou diferenças na suscetibilidade ao vírus, porém a carga viral foi diminuída pela Wolbachia no DENV-4, em ambas as formas de infecção.

Foi possível a detecção de pools positivos independente da forma de infecção, demonstrando que a transmissão vertical do vírus dengue ocorreu, porém a proporção de pools positivos entre os grupos Mel e Tet não foi alterada. Entretanto, pudemos observar uma diminuição da carga viral nos pools positivos Mel. Os ovários na infecção oral, interessantemente, tiveram uma forte diminuição da suscetibilidade conferida pela Wolbachia. A carga viral dos ovários foi diminuída em DENV-1 e DENV-4, em ambas as formas de infecção. Os dados obtidos nestes experimentos apontam que a transmissão vertical do vírus dengue ocorreu em pequenas taxas. Independente da forma de infecção utilizada, as taxas não variaram, mostrando que os mecanismos que regulam a ocorrência da transmissão vertical precisam ser explorados. Concluímos que, a Wolbachia pode potencialmente ser responsável pela redução da transmissão vertical em campo. Isto é considerado um grande avanço no controle da dengue, se realmente for comprovada que a transmissão vertical é a responsável pela manutenção do vírus em períodos inter-epidêmicos.

Pleiotropic impact of endosymbiont load and co-occurrence in the maize weevil Sitophilus zeamais.

Individual traits vary among and within populations, and the co-occurrence of different endosymbiont species within a host may take place under varying endosymbiont loads in each individual host. This makes the recognition of the potential impact of such endosymbiont associations in insect species difficult, particularly in insect pest species. The maize weevil, Sitophilus zeamais Motsch. (Coleoptera: Curculionidae), a key pest species of stored cereal grains, exhibits associations with two endosymbiotic bacteria: the obligatory endosymbiont SZPE ("Sitophilus zeamais Primary Endosymbiont") and the facultative endosymbiont Wolbachia. The impact of the lack of SZPE in maize weevil physiology is the impairment of nutrient acquisition and energy metabolism, while Wolbachia is an important factor in reproductive incompatibility. However, the role of endosymbiont load and co-occurrence in insect behavior, grain consumption, body mass and subsequent reproductive factors has not yet been explored. Here we report on the impacts of co-occurrence and varying endosymbiont loads achieved via thermal treatment and antibiotic provision via ingested water in the maize weevil. SZPE exhibited strong effects on respiration rate, grain consumption and weevil body mass, with observed effects on weevil behavior, particularly flight activity, and potential consequences for the management of this pest species. Wolbachia directly favored weevil fertility and exhibited only mild indirect effects, usually enhancing the SZPE effect. SZPE suppression delayed weevil emergence, which reduced the insect population growth rate, and the thermal inactivation of both symbionts prevented insect reproduction. Such findings are likely important for strain divergences reported in the maize weevil and their control, aspects still deserving future attention.

Detecção da bactéria Wolbachia em insetos através da técnica LAMP (amplificação isotérmica mediada por loop)

Wolbachia pipientis é uma bactéria intracelular que infecta cerca de 40% dos artrópodes e alguns nematódeos, causando alterações reprodutivas em seus hospedeiros. Recentemente, duas cepas de Wolbachia (wMelPop e wMel)foram inseridas individualmente em Aedes aegypti (não infectado naturalmente)e os mosquitos adultos contendo a Wolbachia foram menos suscetíveis a diferentes arboviroses (Dengue e Chikungunya) bem como ao Plasmodium sp. Atualmente, mosquitos A. aegypti contendo Wolbachia (wMel) estão sendo liberados a campo em diversos países, pelo Programa Eliminate Dengue, como possível agente de controle biológico de Dengue. Durante o processo de invasão de mosquitos contendo Wolbachia no campo, há a necessidade de realização de coletas e screening semanal de grandes quantidades de mosquitos para detecção de Wolbachia, via PCR quantitativo, técnica ainda bastante onerosa. Diante disto, é imprescindível o desenvolvimento de um método rápido, específico e de baixo custo para detecção de mosquitos infectados com a bactéria, para levantamento e monitoramento da disseminação da Wolbachia em campo. No presente trabalho, desenvolvemos com sucesso um método rápido de detecção através do LAMP (Amplificação isotérmica mediada por loop) que utiliza 3 pares de primers que se ligam em 8 regiões distintas do DNA alvo, o que torna a reação bastante específica. Em nosso caso, desenhamos iniciadores baseando-se na sequência alvo do gene 16S rRNA da bactéria. Para padronização, foram utilizados mosquitos da colônia do Insetário do Laboratório de Malária do CPqRR, infectados e não infectados por Wolbachia, além de insetos de campo (mosquitos e insetos de diferentes ordens) doados por colaboradores. O tempo de incubação estabelecido para a amplificação foi de 90 minutos à 63oC, sendo possível a realização da reação tanto em termociclador, como em banho seco.

Para análise da sensibilidade, foi feita a diluição seriada de plasmídeo contendo a sequência alvo de 109 à 100 cópias, sendo possível a amplificação utilizando apenas 1 cópia do DNA. Para verificar a especificidade, foram utilizadas amostras de diferentes espécies de bactérias e em nenhuma delas ocorreu a amplificação, confirmando que o LAMP é bastante específico. Uma maneira de reduzir os custos foi através da redução da concentração da enzima Bst DNA polimerase por reação e, com apenas 1 unidade, a amplificação ocorreu de maneira eficiente. Para visualização dos resultados, foram utilizados dois corantes, o azul de hidroxinaftol (HNB) e SYBR Green I. Em ambos foi possível diferenciar as amostras positivas das negativas sem a necessidade de géis de agarose, sendo que, com o HNB, não há manipulação de produto amplificado pois é adicionado antes da reação, o que evita possíveis contaminações, e também é possível observar a diferença de cores a olho nu, sem o uso de luz UV. Comparando os custos, em reais, para realização da técnica de PCR e LAMP, esta apresentou um custo de 53,92% menor em relação ao PCR, o que confirma ser uma técnica de baixo custo, já que não requer equipamentos sofisticados e nem eletroforese em gel de agarose para análise dos resultados.Desenvolvemos, neste trabalho, uma técnica para detecção de Wolbachia bastante especifica, rápida, sensível e de baixo custo a qual possibilita seu uso em larga escala para monitoramento de diversas espécies de insetos infectadas no campo.

Detecção da bactéria Wolbachia em insetos através da técnica LAMP (amplificação isotérmica mediada por loop) / Detection of Wolbachia bacteria in insects through the LAMP technique (isothermal amplification Loop-mediated)

Wolbachia pipientis é uma bactéria intracelular que infecta cerca de 40% dos artrópodes e alguns nematódeos, causando alterações reprodutivas em seus hospedeiros. Recentemente, duas cepas de Wolbachia (wMelPop e wMel)foram inseridas individualmente em Aedes aegypti (não infectado naturalmente)e os mosquitos adultos contendo a Wolbachia foram menos suscetíveis a diferentes arboviroses (Dengue e Chikungunya) bem como ao Plasmodium sp. Atualmente, mosquitos A. aegypti contendo Wolbachia (wMel) estão sendo liberados a campo em diversos países, pelo Programa Eliminate Dengue, como possível agente de controle biológico de Dengue. Durante o processo de invasão de mosquitos contendo Wolbachia no campo, há a necessidade de realização de coletas e screening semanal de grandes quantidades de mosquitos para detecção de Wolbachia, via PCR quantitativo, técnica ainda bastante onerosa. Diante disto, é imprescindível o desenvolvimento de um método rápido, específico e de baixo custo para detecção de mosquitos infectados com a bactéria, para levantamento e monitoramento da disseminação da Wolbachia em campo. No presente trabalho, desenvolvemos com sucesso um método rápido de detecção através do LAMP (Amplificação isotérmica mediada por loop) que utiliza 3 pares de primers que se ligam em 8 regiões distintas do DNA alvo, o que torna a reação bastante específica. Em nosso caso, desenhamos iniciadores baseando-se na sequência alvo do gene 16S rRNA da bactéria. Para padronização, foram utilizados mosquitos da colônia do Insetário do Laboratório de Malária do CPqRR, infectados e não infectados por Wolbachia, além de insetos de campo (mosquitos e insetos de diferentes ordens) doados por colaboradores. O tempo de incubação estabelecido para a amplificação foi de 90 minutos à 63oC, sendo possível a realização da reação tanto em termociclador, como em banho seco...

Para análise da sensibilidade, foi feita a diluição seriada de plasmídeo contendo a sequência alvo de 109 à 100 cópias, sendo possível a amplificação utilizando apenas 1 cópia do DNA. Para verificar a especificidade, foram utilizadas amostras de diferentes espécies de bactérias e em nenhuma delas ocorreu a amplificação, confirmando que o LAMP é bastante específico. Uma maneira de reduzir os custos foi através da redução da concentração da enzima Bst DNA polimerase por reação e, com apenas 1 unidade, a amplificação ocorreu de maneira eficiente. Para visualização dos resultados, foram utilizados dois corantes, o azul de hidroxinaftol (HNB) e SYBR Green I. Em ambos foi possível diferenciar as amostras positivas das negativas sem a necessidade de géis de agarose, sendo que, com o HNB, não há manipulação de produto amplificado pois é adicionado antes da reação, o que evita possíveis contaminações, e também é possível observar a diferença de cores a olho nu, sem o uso de luz UV. Comparando os custos, em reais, para realização da técnica de PCR e LAMP, esta apresentou um custo de 53,92% menor em relação ao PCR, o que confirma ser uma técnica de baixo custo, já que não requer equipamentos sofisticados e nem eletroforese em gel de agarose para análise dos resultados.Desenvolvemos, neste trabalho, uma técnica para detecção de Wolbachia bastante especifica, rápida, sensível e de baixo custo a qual possibilita seu uso em larga escala para monitoramento de diversas espécies de insetos infectadas no campo...

Wolbachia pipientis is associated with different mitochondrial haplotypes in natural populations of Drosophila willistoni.

The prevalence of the endosymbiont Wolbachia pipientis and its effects on mitochondrial genetic diversity were analyzed in natural populations of Drosophila willistoni, a neotropical species recently infected. Total infection rate was 55% and no evidence was found that the Wolbachia infection decreased the diversity of mtDNA. Wolbachia was seen to be associated with different mitochondria, suggesting multiple horizontal transmission events and/or transmission paternal leakage of mitochondrial and/or Wolbachia. These hypotheses are evaluated in the context of the present study and other research.

Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae).

Wolbachia are α-proteobacteria that were first reported in Culex pipiens mosquitoes early in the twentieth century. Since then, the effect of Wolbachia on their host's reproduction has drawn attention and has been increasingly investigated. Given the extreme complexity of this interaction, new study cases are welcomed to enhance its understanding. The present work addressed the influence of Wolbachia on Cx. quinquefasciatus, the cosmopolitan member of the Cx. pipiens complex. Samples of a Cx. quinquefasciatus colony (wPip(+)) originated from individuals naturally infected by Wolbachiapipientis B strain, were cured with tetracycline, yielding a Wolbachia-free colony (wPip(-)). Both the presence of bacteria and the efficiency of bacterial elimination were checked by PCR of the wsp gene. Total reproductive unidirectional incompatibility occurred when wPip(-) females were crossed with wPip(+) males, whereas the other three types of reciprocal crosses were viable. Reproductive aspects were also comparatively evaluated between colonies. Concerning oviposition time during the first gonotrophic cycle, wPip(+) females developed and laid eggs earlier than did wPip(-) females. Reproductive fitness was higher among wPip(-) than wPip(+) females regarding the following parameters: fertility: egg rafts/fed females; fecundity: eggs/raft, and viability: larvae/eggs. Conversely, longevity of wPip(-) females was lower. Summarising, although the infected mosquitoes have the advantage of a higher longevity, they have lower reproductive fitness. Our results are partly distinct from all other reports on Aedes and Culex mosquitoes previously published.

Mito-nuclear genetic comparison in a Wolbachia infected weevil: insights on reproductive mode, infection age and evolutionary forces shaping genetic variation.

BACKGROUND: Maternally inherited endosymbionts like Wolbachia pipientis are in linkage disequilibrium with the mtDNA of their hosts. Therefore, they can induce selective sweeps, decreasing genetic diversity over many generations. This sex ratio distorter, that is involved in the origin of parthenogenesis and other reproductive alterations, infects the parthenogenetic weevil Naupactus cervinus, a serious pest of ornamental and fruit plants. RESULTS: Molecular evolution analyses of mitochondrial (COI) and nuclear (ITS1) sequences from 309 individuals of Naupactus cervinus sampled over a broad range of its geographical distribution were carried out. Our results demonstrate lack of recombination in the nuclear fragment, non-random association between nuclear and mitochondrial genomes and the consequent coevolution of both genomes, being an indirect evidence of apomixis. This weevil is infected by a single Wolbachia strain, which could have caused a moderate bottleneck in the invaded population which survived the initial infection. CONCLUSIONS: Clonal reproduction and Wolbachia infection induce the coevolution of bacterial, mitochondrial and nuclear genomes. The time elapsed since the Wolbachia invasion would have erased the traces of the demographic crash in the mtDNA, being the nuclear genome the only one that retained the signal of the bottleneck. The amount of genetic change accumulated in the mtDNA and the high prevalence of Wolbachia in all populations of N. cervinus agree with the hypothesis of an ancient infection. Wolbachia probably had great influence in shaping the genetic diversity of N. cervinus. However, it would have not caused the extinction of males, since sexual and asexual infected lineages coexisted until recent times.

Does Wolbachia infection affect Trichogramma atopovirilia behaviour? / A infecção por Wolbachia afeta o comportamento de Trichogramma atopovirilia?

Unisexual Trichogramma forms have attracted much attention due to their potential advantages as biocontrol agents. Fitness studies have been performed and understanding the cost that Wolbachia may inflict on their hosts will help in deciding if Wolbachia infected (unisexual) forms are indeed better than sexual forms when used in biological control programmes. The influence of Wolbachia on the foraging behaviour (including walking activity and speed) of T. atopovirilia is reported in this paper. Temperature strongly affected T. atopovirilia female walking activity, but Wolbachia infected and uninfected females differed in none of the behavioural components that were measured such as walking activity and walking speed. Walking activity was highest at 25 ºC and differed significantly from that at 20 and 15 ºC. Trichogramma wasps were highly affected at 15 ºC. Behaviour analysis with females showed that female wasps spend most of the time on drilling + ovipositing on host eggs followed by host drumming and walking while drumming. The parasitism rate and number of offspring did not differ significantly between infected and cured Trichogramma females. Biological control implications of these findings are discussed.(AU)

Formas unissexuais de Trichogramma têm despertado a atenção de pesquisadores devido as potenciais vantagens deste parasitóide como agente de controle biológico. O estudo do "Fitness" tem sido avaliado e entender o custo de ser infectado por Wolbachia ajudará em determinar se formas infectadas por Wolbachia (unisexuais) são realmente melhores que as sexuadas quando utilizadas em programas de controle biológico. A influência de Wolbachia no comportamento de procura (incluindo a atividade e a velocidade de caminhamento) de T. atopovirilia é relatada neste artigo. A temperatura afetou grandemente a atividade de caminhamento de fêmeas de T. atopovirilia, entretanto os componentes de comportamento tais como a atividade e a velocidade de caminhamento não diferiram em relação às fêmeas infectadas e não infectadas. A atividade de caminhamento foi maior a 25 ºC e diferiu significativamente de 20 e 15 ºC. Fêmeas de Trichogramma foram altamente afetados a 15 ºC. Em função da análise do comportamento com fêmeas, pode-se verificar que houve maior tempo gasto no processo de oviposição, seguido pelo toque com as antenas sobre os ovos dos hospedeiros e do caminhamento ao mesmo tempo que toca os ovos com as antenas. A taxa de parasitismo e o número de descendentes não diferiram significativamente entre fêmeas de Trichogramma infectadas e curadas da infecção por Wolbachia. As implicações dos resultados obtidos sobre o controle biológico são discutidas.(AU)