Code of Ethics and Conduct of the Brazilian Association of Embryologists - PRONÚCLEO.

For more than three decades, Brazilian Clinical Embryologists have been working without specific regulations and following the standards adopted by other healthcare professionals. This document aims to guide behavior and decision-making, while providing directions to embryologist with the purpose of aiding professionals involved with assisted reproduction procedures and their patients. The Code of Ethics and Conduct is an important breakthrough and the first step toward regulating Clinical Embryology as a profession.

In vitro fertilization of porcine oocytes is affected by spermatic coincubation time / A fertilização in vitro de ovócitos suínos é afetada pelo tempo de coincubação espermático

The aim was to study the effects of different gamete coincubation times on porcine in vitro fertilization (IVF), and to verify whether efficiency could be improved by reducing oocyte exposure time to spermatozoa during IVF. In groups of 50, a total of 508 immature cumulus-oocyte complexes (COCs) were matured in NCSU-37 medium. The COCs were cultured for 44 hours and then inseminated with in natura semen (2,000 spermatozoa/oocyte). The sperm and oocytes were coincubated according to the following treatments (T): T1 = oocytes exposed to spermatozoa for one hour (173 oocytes), T2 = oocytes exposed to spermatozoa for two hours (170 oocytes), and T3 = oocytes exposed to spermatozoa for three hours (165 oocytes). After these coincubation periods, the oocytes were washed in fertilization medium (TALP medium) to remove spermatozoa not bound to the zona pellucida and cultured in another similar medium (containing no sperm). Eighteen to twenty hours after fertilization, the putative zygotes were stained in Hoechst-33342 to evaluate the IVF results. The penetration rate was higher (P<0.05) after two hours of coincubation time than it was for one or three hours. Furthermore, 68.60% of the ova coincubated with the spermatozoa for two hours were monospermic. The oocytes exposed to spermatozoa for one hour (T1) presented a higher (P<0.01) rate of polyspermy than those in T2 and T3. Fertilization performance (%) did not differ (P>0.05) between oocytes exposed to spermatozoa for one (T1) and three hours (T3). However, optimum (P=0.048) results were obtained after two hours of coincubation, when the rate of fertilization performance was 50.16±8.52%. The number of penetrated sperm per oocyte, as well as male pronucleus formation, did not differ (P>0.05) between the treatments evaluated. Under these assay conditions, especially in relation to the sperm concentration used, gamete coincubation for a period of two hours appears to be optimal for monospermy and fertilization performance. Thus, it is the optimal time period for obtaining a large number of pig embryos capable of normal development.(AU)

Esse estudo foi realizado para avaliar os efeitos de diferentes tempos de coincubação dos gametas sobre a fertilização in vitro (FIV) de suínos e se a eficiência dessa técnica poderia ser melhorada pela redução no período que os ovócitos são expostos aos espermatozoides durante a FIV. Um total de 508 (em grupos de 50) complexos cumulus-ovócito (COCs) imaturos foram maturados no meio NCSU-37. Os COCs foram cultivados por 40-44 horas e então inseminados com sêmen in natura (2.000 espermatozoides/ovócito). Os espermatozoides e ovócitos foram coincubados de acordo com os seguintes tratamentos (T): T1 = ovócitos expostos aos espermatozoides por uma hora (173 ovócitos); T2 = ovócitos expostos aos espermatozoides por duas horas (170 ovócitos) e T3 = ovócitos expostos aos espermatozoides por três horas (165 ovócitos). Após esses períodos de coincubação, os ovócitos foram lavados em meio de fertilização (meio TALP) para remoção dos espermazoides não ligados a zona pelúcida e cultivados em outro mesmo meio (não contendo espermatozoides). Após 18-20 horas de fertilização, os prováveis zigotos foram corados com Hoechst-33342 para avaliação dos resultados da FIV. A taxa de penetração foi maior (P<0,05) após o tempo de coincubação de duas horas em comparação a uma e três horas. Além disso, 68,60% dos ovócitos coincubados com os espermatozoides por duas horas foram monospérmicos. Os ovócitos expostos aos espermatozoides por uma hora (T1) apresentaram elevada (P<0,01) taxa de polispermia em comparação com o T2 e T3. A eficiência da fertilização (%) não diferiu (P>0,05) entre os ovócitos expostos aos espermatozoides por uma (T1) e três horas (T3). Entretanto, ótimos (P=0,048) resultados foram obtidos após duas horas de coincubação, quando a taxa da eficiência da fertilização foi 50,16 ± 8,52%. O número de espermatozoides penetrados por ovócito e a formação de pro-núcleo masculino não diferiu (P>0,05) entre os tratamentos avaliados. Sob as condições de ensaio realizadas, especialmente em relação à concentração espermática utilizada, a coincubação dos gametas por um período de duas horas parece ser ótima para as taxas de monospermia e eficiência da fertilização. Portanto, um tempo provavelmente ótimo para obter um elevado número de embriões suínos capazes de ter um desenvolvimento normal.(AU)

Oocyte activation and preimplantation development of bovine embryos obtained by specific inhibition of cyclin-dependent kinases

The efficiency of bohemine and roscovitine in combination with ionomycin on parthenogenetic activation and initial embryonic development of bovine oocytes was studied. Two experiments were performed: in the first, different concentrations (0, 50, 75 or 100æM) and different exposure periods (2, 4 or 6 hours) to bohemine or roscovitine were tested for activation rates of in vitro matured (IVM) bovine oocytes, which were pre-exposed to ionomycin. The best treatments, 75µM bohemine and 50µM roscovitine, both for 6h, were used in the second experiment, in which IVM bovine oocytes were exposed to ionomycin, followed or not by bohemine or roscovitine treatment, and evaluated for nuclear status, activation rate and blastocyst development were assessed. The combined treatments (ionomycin + cyclin-dependent kinases inhibitors - CDKIs) showed better results for activation rates (77.3 percent) and initial embryonic development (35.2 percent) than the single ionomycin treatment (69.4 percent for activation and 21.9 percent for development); and also lead to a more uniform activation (nearly 90 percent single pronucleus development). The results showed that CDKIs improve the effects of ionomycin on parthenogenetic activation and blastocyst development in bovine oocytes and could help to achieve more efficient activation protocols, increasing the developmental competence of embryos obtained by reproductive biotechniques.

Realizaram-se dois experimentos para avaliar a eficiência da bohemina e roscovitina associadas à ionomicina para ativação partenogenética e desenvolvimento embrionário inicial de bovinos. No primeiro, foram testadas diferentes concentrações (0, 50, 75 ou 100æM) e diferentes tempos de exposição (2, 4 ou 6 horas) à bohemina ou à roscovitina na ativação de oócitos bovinos maturados in vitro (MIV) pré-expostos à ionomicina. Os melhores tratamentos, bohemina 75µM e roscovitina 50µM, ambos por seis horas, foram utilizados no segundo experimento, no qual oócitos bovinos MIV foram expostos à ionomicina seguido ou não pelo tratamento com inibidores específicos das quinases dependentes de ciclina (CDKI), e avaliados quanto à configuração nuclear, taxa de ativação e desenvolvimento até blastocisto. Os tratamentos combinados (ionomicina+CDKI) apresentaram melhor taxa de ativação (77,3 por cento) e desenvolvimento embrionário inicial (35,2 por cento) do que a ionomicina sozinha (69,4 por cento e 21,9 por cento, respectivamente), e também promoveram ativação mais uniforme (aproximadamente 90 por cento de formação de um pronúcleo). Estes resultados demonstram que os CDKIs potencializam o efeito da ionomicina na ativação e desenvolvimento embrionário inicial e podem auxiliar na obtenção de protocolos de ativação mais eficientes, aumentando a capacidade de desenvolvimento de embriões produzidos por meio de biotécnicas reprodutivas.

Gravidez e nascimento resultante de transferência de embrião com um pró-núcleo após falhas consecutivas de FIV / Pregnancy and birth following an one pronucleus embryo transfer after consecutives Ivf failures

Este caso relata uma gravidez bem-sucedida e nascimento após a transferência de embrião derivado de óvulo com apenas um pró-núcleo (PN). O casal havia se submetido a quatro ciclos de indução da ovulação com três transferências embrionárias. Esta paciente tinha uma diminuição da reserva ovariana, evidenciados através de um volume ovariano pequeno, FSH elevado e má resposta à estimulação ovariana previamente. Na primeira tentativa em nosso serviço, foi proposto um protocolo curto com microdose do agonista do GnRH. A observação de um único PN no tempo habitual de checagem de fertilização pode não parecer ser um indicador absoluto de incompetência no desenvolvimento. Uma vez que não se tinha outros embriões disponíveis, e sucessivas falhas anteriores, este embrião foi transferido, resultando numa gravidez a termo com nascimento de uma criança saudável do sexo masculino.

Evaluación citológica de la falla de fertilización en el ICSI / Cytology valuation of failed of fertilization after intracytoplasmic sperm injection

Objetivo: Determinar si la falla de fertilización en el ICSI fue debida a problemas técnicos o a la calidad intrínseca de las gametas. Diseño: Aplicación de la técnica de Tarkowski en los ovocitos que no evindeciaron pronúcleos entre las 15 y 19 horas ni clivaron entre las 40y 48 horas después de efectuado el ICSI. Pacientes: Ovocitos no fertilizados provenientes de 152 mujeres que accedieron a 221 ciclos de ICSI, correspondiendo 82 por ciento a factores masculinos y 18 por ciento a fallas previas de FIV. Principal evolución: El hallazgo citológico de los ovocitos no fertilizados luego del ICSI. Resultados: De los 158 ovocitos citológicamente procesados, 32 fueron no informativos. En los 126 informativos los hallazgos fueron los siguientes: 16 (12,7 por ciento) ovocitos sin la presencia del espermatozoide inyectado, 32 (25,5 por ciento) con la presencia de un espermatozoide intacto, 14 (11 por ciento) con el espermatozoide hinchado, 34 (27 por ciento) con cromosomas de espermatozoides dispersos (condensación prematura de los cromosomas del espermatozoide), 1 (0,8 por ciento) con un pronúcleo, 19 (15 por ciento) con dos pronúcleos, 1 (0,8 por ciento) con cuatro pronúcleos, 2 (1,6 por ciento) con dos complementos haploides de cromosomas mitóticos correspondientes a los pronúcleos, 2 (1,6 por ciento) con un núcleo singámico y 5 (4 por ciento) con un complemento diploide de cromosomas mitóticos correspondiente a la primera división mitótica. Conclusiones: Las principales causas de fallas fueron ovocitos no embriogénicos (50,5 por ciento) e incapacidad fertilizante del espermatozoide (36,5 por ciento). El 13 por ciento fue debida a problemas técnicos de la inyección

Evaluación citológica de la falla de fertilización en el ICSI / Cytology valuation of failed of fertilization after intracytoplasmic sperm injection

Objetivo: Determinar si la falla de fertilización en el ICSI fue debida a problemas técnicos o a la calidad intrínseca de las gametas. Diseño: Aplicación de la técnica de Tarkowski en los ovocitos que no evindeciaron pronúcleos entre las 15 y 19 horas ni clivaron entre las 40y 48 horas después de efectuado el ICSI. Pacientes: Ovocitos no fertilizados provenientes de 152 mujeres que accedieron a 221 ciclos de ICSI, correspondiendo 82 por ciento a factores masculinos y 18 por ciento a fallas previas de FIV. Principal evolución: El hallazgo citológico de los ovocitos no fertilizados luego del ICSI. Resultados: De los 158 ovocitos citológicamente procesados, 32 fueron no informativos. En los 126 informativos los hallazgos fueron los siguientes: 16 (12,7 por ciento) ovocitos sin la presencia del espermatozoide inyectado, 32 (25,5 por ciento) con la presencia de un espermatozoide intacto, 14 (11 por ciento) con el espermatozoide hinchado, 34 (27 por ciento) con cromosomas de espermatozoides dispersos (condensación prematura de los cromosomas del espermatozoide), 1 (0,8 por ciento) con un pronúcleo, 19 (15 por ciento) con dos pronúcleos, 1 (0,8 por ciento) con cuatro pronúcleos, 2 (1,6 por ciento) con dos complementos haploides de cromosomas mitóticos correspondientes a los pronúcleos, 2 (1,6 por ciento) con un núcleo singámico y 5 (4 por ciento) con un complemento diploide de cromosomas mitóticos correspondiente a la primera división mitótica. Conclusiones: Las principales causas de fallas fueron ovocitos no embriogénicos (50,5 por ciento) e incapacidad fertilizante del espermatozoide (36,5 por ciento). El 13 por ciento fue debida a problemas técnicos de la inyección (AU)

El concepto de normalidad durante el desarrollo preimplantación del huevo humano: análisis ultraestructural de cuatro embriones / Normality concept during human egg preimplantation development: structural analysis of 4 embryos

Se analizó la ultraestructura de 4 huevos humanos al estado de: pronúcleo, dos, cuatro y siete células. Los embriones, se recogieron después de lavado de trompas de Falopio, desde mujeres sanas y de probada fertilidad que habían solicitado ser esterilizadas quirúrgicamente. Las intervenciones se realizaron a diferentes lapsos de tiempo después de detectado el pico de LH en plasma. Después de la colecta, los huevos se prepararon para microscopía electrónica de acuerdo a las técnicas convencionales. Los huevos cursaban un proceso de desarrollo normal al momento de la colecta. Tanto la morfología de los huevos y sus anexos, como las características ultraestructurales de los organelos citoplasmáticos, correspondían a huevos con un desarrollo aparentemente normal. Entre las características más relevantes estaban: la presencia de fragmentos citoplasmáticos en el espacio perivitelino, la distribución espacial de los organelos citoplasmáticos en los blastómeros, la estrecha relación entre el retículo endoplasmático liso y las mitocondrias, la actividad de yemación de la membrana nuclear y finalmente la organización estructural del nucléolo. Este trabajo presenta a nivel ultraestructural algunas características únicas que pueden tener relación con la ontogénesis de los organelos celulares y diferenciación celular. Además, se revelan detalles estructurales que pueden tener una expresión a nivel de microscopía óptica y pueden servir para una mejor evaluación de especímenes vivos en programas de fecundación in vitro

Programa de fecundación en vitro: resultados preliminares / In vitro fertilization program: preliminary results

Tres parejas con infertilidad conyuugal fueron sometidas a fertilización in vitro y transferencia uterina (FIV+TU) y 7 a fertilización in vitro y transferencia a la trompa de embriones en estado de pronúcleo (FIV+PROST). Para programar la menstruación, se administraron 10 mg diarios de noretisterona (NET) durante el ciclo anterior al de hiperestimulación ovárica. Con el objeto de inhibir la producción endógena de FSH y LH se indicó acetato de leuprolide, un agonista Gn Rh, 1 mg subcutáneos diarios durante 6 días y posteriormente 0,5 mg diarios desde la mitad del ciclo anterior al de hiperestimulación hasta el día de la administración de HCG. Para provocar la superovulación se empleó FSH pura (Metrodine), HMG (Pergonal) y HCG (Endocorion). La recuperación del ovicitos se efectuó por vía transvaginal bajo control ecográfico. Los procedimientos de identificación de ovocitos y embriones, separación y capacitación de espermatozoides e inseminación e incubación de gametos se practicarón con técnicas habituales. La transferencia a las trompas de los embriones en estado de pronúcleo se efectuó por vía translaparoscópica 17 horas después de la inseminación y la transferencia de embriones al útero por vía transcervical 48 horas después. Nueve de 10 pacientes respondieron a la estimulación de gonadatrofina y fueron sometidos a punción ovárica. Se recuperaron 69 ovocitos (7,6 por paciente) de los cuales 59 (81,15%) fueron maduros. El 74,55% de los ovocitos inseminados fertilizaron. Dos pacientes se embarazaron: una de FIV+PROST cursa un embarazo gemelar triple del primer trimestre y la segunda de FIV+TU presentó un aborto retenido a las 8 semanas de embarazo