In vitro anti-inflammatory activity of Plantago major L. and Piper aduncum L. on phospholipase A2 from the venom of snake Lachesis muta muta. / Actividad antiinflamatoria in vitro de Plantago major L. y Piper aduncum L. sobre la fosfolipasa A2 del veneno de la serpiente Lachesis muta muta.

OBJECTIVE.: To evaluate the in vitro inhibitory activity of Plantago major "llantén" and Piper aduncum "matico" extracts on phospholipase A2 (PLA2) from the venom of the snake Lachesis muta muta. MATERIALS AND METHODS.: We carried out an explanatory study with experimental design. Leaves of P. major and P. aduncum were collected in the province of Huarochirí in Lima, Peru. Then, we prepared alcoholic extracts diluted in distilled water and conducted phytochemical assays, quantification of phenols and flavonoids, thin layer chromatography (TLC) on cellulose and enzymatic activity with PLA2. The ability to inhibit PLA2 with the extracts under study and their fractions was analyzed. The Kruskal Wallis test and Bonferroni multiple comparisons were used during statistical analysis. RESULTS.: Phenols, flavonoids and tannins were qualitatively identified in both P. major and P. aduncum; in addition, P. aduncum presented saponins. The inhibition of PLA2 activity of the venom by the total extract of P. major was 45.3%, and its fractions showed the following inhibition values: 31.1% for LLF-1, 66.3% for LLF-2 and 65.5% for LLF-3. The inhibition values for the total extract of P. aduncum were 86.9%, and its fractions showed the following inhibition rates: 34.3% for MF-1, 67.1% for MF-2 and 54.9% for MF-3. Statistical analysis showed significant differences in the inhibition of PLA2 (p=0.009) by the extracts. CONCLUSION.: The tests demonstrated an association between the anti-inflammatory effect of the extracts and PLA2 inhibition.

OBJETIVO.: Evaluar la actividad inhibitoria in vitro de los extractos de Plantago major «llantén¼ y Piper aduncum «matico¼ sobre Fosfolipasa A2 (PLA2) del veneno de la serpiente Lachesis muta muta. MATERIALES Y MÉTODOS.: Esta investigación fue de tipo explicativa con diseño experimental. Se recolectaron hojas de P. major y P. aduncum en la provincia de Huarochirí en Lima, Perú. Se prepararon extractos alcohólicos diluidos en agua destilada y se realizaron los ensayos fitoquímicos, la cuantificación de fenoles y flavonoides, la cromatografía de capa fina (CCF) en celulosa y la actividad enzimática con PLA2. Se analizó la capacidad de inhibir la PLA2 con los extractos en estudio y sus fracciones. Para el análisis estadístico se utilizó la prueba de Kruskal Wallis y comparaciones múltiples de Bonferroni. RESULTADOS.: Tanto en P. major como en P. aduncum se identificó cualitativamente la presencia de fenoles, flavonoides y taninos; además, P. aduncum presentó saponinas. La inhibición de la actividad de la PLA2 del veneno por el extracto total de P. major fue del 45,3%, y sus fracciones mostraron valores de inhibición: LLF-1 con 31,1%, LLF-2 con 66,3% y LLF-3 con 65,5%. En P. aduncum, los valores de inhibición para el extracto total fueron de 86,9%, y sus fracciones presentaron inhibiciones: MF-1 con 34,3%, MF-2 con 67,1% y MF-3 con 54,9%. El análisis estadístico demostró diferencias significativas en la inhibición de la PLA2 (p=0,009) por los extractos. CONCLUSIÓN.: Los ensayos realizados demostraron una asociación entre el efecto antiinflamatorio de los extractos y la inhibición de la PLA2.

Actividad antiinflamatoria in vitro de Plantago major L. y Piper aduncum L. sobre la fosfolipasa A2 del veneno de la serpiente Lachesis muta muta / In vitro anti-inflammatory activity of Plantago major L. and Piper aduncum L. on phospholipase A2 from the venom of snake Lachesis muta muta

Objetivo. Evaluar la actividad inhibitoria in vitro de los extractos de Plantago major «llantén» y Piper aduncum «matico» sobre Fosfolipasa A2 (PLA2) del veneno de la serpiente Lachesis muta muta. Materiales y métodos. Esta investigación fue de tipo explicativa con diseño experimental. Se recolectaron hojas de P. major y P. aduncum en la provincia de Huarochirí en Lima, Perú. Se prepararon extractos alcohólicos diluidos en agua destilada y se realizaron los ensayos fitoquímicos, la cuantificación de fenoles y flavonoides, la cromatografía de capa fina (CCF) en celulosa y la actividad enzimática con PLA2. Se analizó la capacidad de inhibir la PLA2 con los extractos en estudio y sus fracciones. Para el análisis estadístico se utilizó la prueba de Kruskal Wallis y comparaciones múltiples de Bonferroni. Resultados. Tanto en P. major como en P. aduncum se identificó cualitativamente la presencia de fenoles, flavonoides y taninos; además, P. aduncum presentó saponinas. La inhibición de la actividad de la PLA2 del veneno por el extracto total de P. major fue del 45,3%, y sus fracciones mostraron valores de inhibición: LLF-1 con 31,1%, LLF-2 con 66,3% y LLF-3 con 65,5%. En P. aduncum, los valores de inhibición para el extracto total fueron de 86,9%, y sus fracciones presentaron inhibiciones: MF-1 con 34,3%, MF-2 con 67,1% y MF-3 con 54,9%. El análisis estadístico demostró diferencias significativas en la inhibición de la PLA2 (p=0,009) por los extractos. Conclusión. Los ensayos realizados demostraron una asociación entre el efecto antiinflamatorio de los extractos y la inhibición de la PLA2.

Objective. To evaluate the in vitro inhibitory activity of Plantago major "llantén" and Piper aduncum "matico" extracts on phospholipase A2 (PLA2) from the venom of the snake Lachesis muta muta. Materials and methods. We carried out an explanatory study with experimental design. Leaves of P. major and P. aduncum were collected in the province of Huarochirí in Lima, Peru. Then, we prepared alcoholic extracts diluted in distilled water and conducted phytochemical assays, quantification of phenols and flavonoids, thin layer chromatography (TLC) on cellulose and enzymatic activity with PLA2. The ability to inhibit PLA2 with the extracts under study and their fractions was analyzed. The Kruskal Wallis test and Bonferroni multiple comparisons were used during statistical analysis. Results. Phenols, flavonoids and tannins were qualitatively identified in both P. major and P. aduncum; in addition, P. aduncum presented saponins. The inhibition of PLA2 activity of the venom by the total extract of P. major was 45.3%, and its fractions showed the following inhibition values: 31.1% for LLF-1, 66.3% for LLF-2 and 65.5% for LLF-3. The inhibition values for the total extract of P. aduncum were 86.9%, and its fractions showed the following inhibition rates: 34.3% for MF-1, 67.1% for MF-2 and 54.9% for MF-3. Statistical analysis showed significant differences in the inhibition of PLA2 (p=0.009) by the extracts. Conclusion. The tests demonstrated an association between the anti-inflammatory effect of the extracts and PLA2 inhibition.

Inmunogenicidad del veneno de Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) y su evaluación por métodos inmunoenzimáticos / Immunogenicity of Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) venom and its evaluation by immunoenzymatic methods

Se estudiarón la inmunogenicidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox, "jergón", utilizando los métodos inmunoenzimáticos de ELISA y Western Blot, así como los patrones de reactividad cruzada empleando los venenos de las serpientes Bothrops brazili, Lachesis muta y Crotalus durissus. Para este fin se inmunizaron conejos albinos Nueva Zelanda (2 kg aprox) con cuatro dosis de 500 µg del veneno de B. atrox en un periodo de 90 días. La producción de anticuerpos fue monitoreada mediante la técnica de ELISA, determinándose el título del suero hiperinmune obtenido al final del protocolo de inmunización. Adicionalmente se analizaron los patrones electroforéticos de los venenos en estudio mediante PAGE-SDS y su reactividad frente al suero obtenido mediante ELISA y Western Blot. El esquema de inmunización utilizado permitió una producción sostenida de anticuerpos a partir del día 20 del protocolo. Finalizado este proceso, el título del suero fue calculado en 256000, lo cual mostró la eficacia y practicidad del procedimiento desarrollado. Por otro lado, los venenos estudiados mostraron una heterogeneidad en su composición proteica a partir del análisis de sus patrones electroforéticos, mientras que a partir de los estudios inmunoenzimáticos, se pudo obtener valores de reactividad cruzada entre el veneno de B. atrox y los venenos de B. brazili, L. muta y C. durissus, de 23,7%, 4,0% y 1,8%, respectivamente. Los resultados obtenidos constituyen el paso inicial para posteriores ensayos dirigidos a la optimización en la producción de inmunosueros para el tratamiento del envenenamiento, así como para el desarrollo de kits de diagnóstico e identificación de especies de serpiente.

The immunogenicity of Bothrops atrox, “jergon”, venom was studied using ELISA and Western Blot methods, as well as cross-reactivity patterns against venoms of Bothrops brazili, Lachesis muta and Crotalus durissus. For this purpose, New Zealand white rabbits (2 kg aprox) were immunized with four 500 µg doses of B. atrox venom in a period of 90 days. Antibody production was followed using ELISA technique, and title of hiper-immune serum was determined at the end of immunization protocol. Additionally, electrophoretic patterns of venoms were analyzed by SDS-PAGE and venom reactivity against obtained serum by ELISA and Western Blot. Immunization schedule allowed a pronounced antibody production since day 20 of protocol. At the end of process, serum title was 256000, which demonstrated both efficacy and usefulness of the developed procedure. On the other hand, studied venoms showed a heterogenic protein composition according to their electrophoretic patterns, whereas cross-reactivity values of 23,7%, 4,0% and 1,8% were obtained between B. atrox venom and B. brazili, L. muta and C. durissus venoms, respectively, using immunoenzymatic methods. According to our results, this procedure constitutes an initial step for further assays directed to optimization in immunoserum production for envenoming treatment and development of kits for diagnosis and species identification of snakes.

Identificación molecular y actividad sobre sustratos cromogénitos de la venombina A del veneno de la serpiente peruana bothrops atrox / Molecular identification and activity on substrates of the Peruvian snake venom to venombina cromogenitos bothrops atrox

En el presente trabajo se ha realizado la identificación molecular de la enzima similar a trombina (EST) del veneno de Bothrops atrox y se ha evaluado su actividad enzimática sobre diversos sustratos sintéticos. La enzima fue purificada utilizando tres pasos cromatrográficos, sobre Sephadex G-75, CM-Sephadex C-50 y Agarosa-PAB, determinándose su peso molecular por PAGE-SDS. La identificación molecular de la enzima aislada se realizó por la técnica de peptide mass fingerprinting basada en espectrometría de masas MALDI-TOF y posterior análisis in silico. Las actividades fibrinocoagulante y amidolítica fueron ensayadas sobre fibrinógeno bovino y BApNA, respectivamente, así como la hidrólisis sobre los sustratos cromogénicos específicos S-2238, S-2251 y S-2266. Como resultado de los ensayos bioquímicos y estructurales, la EST del veneno de B. atrox, presentó un peso molecular de 29,6 kDa. El análisis mediante espectrometría de masas de los péptidos obtenidos, permitió identificar a esta enzima como una venombina A, presentando una identidad del 75%. Del análisis de actividad enzimática, se obtuvo que la EST de B. atrox produjo coagulación del fibrinógeno bovino y presentó actividad sobre BApNA, S-2238 y S-2266, siendo incapaz de hidrolizar el sustrato S-2251. El empleo de estas aproximaciones estructurales y funcionales ha permitido lograr la identificación molecular del principal componente del veneno de B. atrox relacionado con su acción coagulante, así como evaluar en detalle la naturaleza de su actividad enzimática sobre diversos sustratos.

Caracterización biológica y acción de inhibidores de una fosfolipasa A2 del veneno de Lachesis muta / Biological characterization and inhibitors action of Phospholipase A2 from Lachesis muta venom

El presente trabajo informa de la purificación y caracterización bioquímica y biológica de la fosfolipasa A2 (PLA2) de Lachesis muta (Linnaeus, 1766). La purificación se realizó por cromatografía liquida (CL) usando CM-Sephadex C-50 y Sephadex G-50, obteniéndola al estado homogéneo con un peso molecular de 18749 Da. Los ensayos con PLA2 realizados sobre fosfolípidos de yema de huevo y lecitina comercial, mostraron que los agentes EDTA, PMSF, glutatión y cisteína, inhibieron la actividad con valores mayores al 50%. La PLA2 de L. muta produjo un notable efecto anticoagulante, observándose un retardo de 2'30' en el tiempo de coagulación con 9,6 microgramos de la enzima. La hemólisis indirecta sobre eritrocitos humanos dio un equivalente de 4,35 microgramos como dosis hemolítica media (HD50). Los valores de dosis edemática media y dosis miotóxica mínima fueron de 91,5 microgramos y 125,89 microgramos/mL respectivamente; valores por debajo de PLA2 de otros venenos. No se registró actividad hemorrágica directa. Las pruebas de inmunodifusión e inmunoelectroforésis revelaron que PLA2 de L. muta tuvo reactividad inmunogénica contra el antiveneno lachésico monovalente (INS-Perú). Sin embargo, la neutralización por el antiveneno fue parcial.

In the present study, phospholipase A2 (PLA2) from Lachesis muta (Linnaeus, 1766), is isolated, purified and characterized biochemically and biologically. Purification was performed by liquid chromatography (LC) using CM-Sephadex C-50 and Sephadex G-50, homogenized enzyme had a molecular weight of 18749 Da. Trials with egg yolk phospholipids, and commercial lecithin showed that EDTA, PMSF, glutathione and cysteine inhibited the activity with values greater than 50%. The PLA2 had a significant anticoagulant effect, showing a delay of 2'30" on the coagulation time with 9.6 microgramos of the enzyme. The indirect impact on human erythrocyte hemolysis gave an equivalent of 4.35 microgramos as HD50. Mean edematic dose and minimum myotoxic dose were 91.5 mg and 125.89 mg / mL respectively, these values were below enzymes phospholipase A2 from others poisons. There was no hemorrhagic activity. Immunodiffusion tests and immunoelectrophoresis revealed that the PLA2 of L. muta was immunogenic reactivity against lachesic monovalent antivenom (INS-Peru). However, the neutralization by the antivenom was partial.

Caracterización de las proteínas totales de tres ecotipos de maca (Lepidium peruvianum G. Chacón), mediante electroforesis unidimensional y bidimensional / Characterization of three maca (Lepidium peruvianum G. Chacon) echotypes' total proteins by unidimensional y bidimensional electrophoresis

Objetivo: Caracterizar las proteínas solubles que se encuentran en la raíz del Lepidium peruvianum G. Chacón, maca, mediante electroforesis unidimensional y electroforesis bidimensional. Diseño: Estudio de tipo observacional y transversal. Lugar: Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición Alberto Guzmán Barrón. Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú. Materiales: Raíces de Lepidium peruvianum G. Chacón æmacaÆ de los ecotipos blanco, amarillo y morado, procedentes de Junín que fueron obtenidas a través de la Universidad Nacional del Centro del Perú. Métodos: La extracción de las proteínas totales solubles se realizó con una solución antioxidante, seguida de electroforesis unidimensional y bidimensional para su caracterización. Principales medidas de resultados: Número de proteínas solubles, peso molecular de las proteínas y puntos isoelectricos de las proteínas más abundantes. Resultados: El análisis electroforético unidimensional mostró predominio de 2 proteínas (72 por ciento de las proteínas solubles totales). Una de 22,5 kDa, denominada en el presente trabajo æmacatinaÆ (51 por ciento de la proteína total); la otra de 17,0 kDa (21 por ciento de la proteína soluble total). El mapa electroforético bidimensional mostró que tanto la æmacatinaÆ como la proteína de 17,0 kDa son básicas y presentan 3 isómeros de carga que se distribuyen en un rango de punto isoeléctrico (pI) de 7,1 a 8,2. Conclusiones: Las proteínas solubles mostraron un patrón electroforético complejo, siendo la macatina la proteína más abundante.

Objective: To characterize soluble proteins present in Lepidium peruvianum G. Chacon æmacaÆ root by both unidimensional and bidimensional electrophoresis. Design: Observational and cross-sectional type study. Setting: Alberto Guzman Barron Biochemistry and Nutrition Research Center, Faculty of Medicine, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Peru. Materials: Roots of Lepidium peruvianum G. Chacon æmacaÆ white, yellow and purple ecotypes, collected in Junin and obtained from Universidad Nacional del Centro del Peru. Methods: Soluble total proteins extraction with an antioxidant solution and characterization by both unidimensional and bidimensional electrophoresis were done. Main outcome measures: Soluble protein number, molecular weight and most abundant proteinsÆ isoelectrical points. Results: The unidimensional electrophoretic analysis showed predominance of two proteins (72 per cent of total soluble proteins): one with 22.5 kDa denominated in the present work as ômacatinaõ (51 per cent of the total protein) and another with 17,0 kDa (21 per cent of total soluble protein). The bidimensional electrophoretic map sample showed that both æmacatinaÆ and the 17,0 kDa protein are basic and display three charge isomers distributed in an isoelectric point (pI) ranging from 7,1 to 8,2. Conclusions: The soluble proteins ecotypes studied showed a complex electrophoretical pattern, being macatina the most abundant protein.

Identificación de porocephalus stilessi (pentastomida) en la serpiente peruana lachesis muta / Identification of porocephalus stilessi (pentastomid) in the peruvian snake lachesis muta

Se realizó la necropsia a una serpiente venenosa Lachesis muta (Familia Vipiridae), procedente de Satipo, Junín, de 1.95 cm de longitud y 9 años, que se encontraba cautiva en el serpentario de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima. Se encontró cuatro pentastómidos en la cavidad corporal y en la serosa pulmonar. Los parásitos fueron fijados en formol al 10 por ciento y diafanizados con lactofenol. El estudio morfológico determinó que tres de ellos eran hembras, pues tenían el gonoporo en el extremo posterior y el cuerpo cilíndrico semejante al de un anélido, en tanto que el cuarto parásito era macho, ya que presentaba la parte anterior dilatada y el poro genital en la región anterior, cerca de la boca. La presencia de 4 ganchos, donde los situados en la zona más externa tenían un apéndice poco esclerotizado y frágil, revelaba que eran adultos. Las hembras presentaban 47 anillos y medían 8.3, 7.5 y 6.9 cm de longitud, y el macho medía 3.7 cm y tenía 39 anillos. Estas características corresponden a individuos de la especie Porocephalus stilessi, considerándose el primer reporte de esta especie en serpientes del Perú.

A necropsy was conducted in a venomus snake Lachesis muta (Family Vipiridae), originary from Satipo, Junín. This snake was 1.95 cm long, 9 years old, and was captive at the serpentarium of Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima. Four pentastomids were found in the corporal cavity and lung serosa. The parasites were fixed in 10 percent formol and cleared with lactofenol. The morphologic evaluation revealed that three of them were females (gonopore close to the end body and cylindrical body shape similar to an annelid) and one male (expanded front body and genital pore near the mouth). The parasites had 4 hooks where two of them showed some sclerotic appendixes compatible with adult forms. Females had 47 rings and a length of 8.3, 7.5 and 6.9 cm, respectively, while the male had 39 rings and a length of 3.7 cm. These characteristics corresponded to the species Porocephalus stilessi. This is the first report of this parasite in Peruvian snakes.

Análisis cromatográfico del contenido enzimático del veneno de tres serpientes peruanas / Chromatography analysis of enzyme content in three Peruvian snake venom

Las serpientes que habitan la selva amazónica tienen venenos cuya composición varía con la especie. Pero existen también especies de coste y otras que son arborícolas cuyo estudio es motivo de interés para este laboratorio. En dos serpientes de costa Bothrops pictus y Bothrops rodengheri así como en una de selva, arborícola, Bothriopsis oligolepis; se ha realizado una exploración de las principales enzimas contenidas en sus venenos luego de efectuar un fraccionamiento cromatográfico. Para ello, muestras de 50 mg. De cada veneno se fraccionaron en una columna de Sephadex G-100 con buffer acetato de amonio 0.05 M, pH 7.0 analizándose luego las actividades enzimáticas de Hialuronidasa, fosfodiesterasa, 5’ nucleotidasa, Similar a Trombina, Proteasa y Fosfolipasa A2. Los resultados mostraron variaciones muy notables en los pisos de proteínas de los venenos utilizados, así como la posición relativa y la actividad de las enzimas en estudio. En el veneno de B. oligolepis se encontraron 3 picos proteicos definidos mientras que las ponzoñas de las serpientes de costa tuvieron perfiles semejantes entre sí. Así mismo las actividades de Fosfodiesterasa, 5’ Nucleotidasa y Hialuronidasa tienen los valores de Ve/ Vo más pequeños, habiéndose encontrado en B. rodengheri esta última actividad, en cambio la Fosfolipasa A2 mostró valores de Ve/Vo notablemente elevados. También se encontraron diferencias en las actividades específicas de las enzimas investigadas pudiéndose deducir a partir de ellas, el rol biológico que cumplirían durante en envenenamiento.

In the Amazonic jungle habit snakes and their venoms have different chemical composition according to species. Besides there are some snakes from coast and others habit on trees having their venoms a particular interest to our laboratory. The venoms of Bothrops pictus and Bothrops rodengheri (both snakes) as well as Bothriopsis oligolepis (tree snake) have been in investigated on enzymatical composition after a chromatographical fractionation. 50 mg of each venom were fractionated on a Sephadex G-100 column, using 0.05 M ammonium acetate pH 7.0 as eluting. Thus, Hyaluronidase, Phosphodisterase, 5’-nucleotidase, Thrombin-like Enzyme, Proteolytic and Phospholipase A2 activities were measured after that. The results showed remarkable variation on peaks of protein obtained, as well as chromatographical position and activity in each case. On B. oligolepis venom three peaks were obtained while protein profile of coast snake venoms were similar. Phosphodiesterase, 5’-nucleotidas and Hyaluronidase exhibited little Ve/Vo values, however Hyaluronidase activity was not registered in B. rodengheri. Phospholipase A showed a great V/V values in all venoms in study. In addition specific activity differences were found among the three venoms, thus a biological effect would be related to these activity values.

Aislamiento y caracterización parcial de una miotoxina del veneno de la serpiente Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) / Isolation and partial characterization of a myotoxin Bothrops atrox snake venom (Ophidia: Viperidae)

Se ha purificado una miotoxina del veneno de la serpiente Bothrops atrox, empleando una columna de intercambio catiónico de CM-Sephadex C-50 equilibrada con buffer acetato de amonio 0,05M a pH 7. La miotoxina es una proteína básica, y por cromatografía de filtración y PAGE-SDS se ha determinado que tiene un peso molecular de 27 kDa, estando formada por dos cadenas polipeptídicas de 14 kDa cada una. La inoculación de la miotoxina en el músculo gastrocnemius de ratones albinos produce la liberación de creatina kinasa así como la necrosis del tejido. La miotoxina tiene actividad de fosfolipasa, anticoagulante y edemática, pero no hemolítica.

Acción de la miotoxina del veneno de Bothrops brazili Hoge, 1953 (Ophidia: Viperidae) / Action of the myotoxin from Bothrops brazili Hoge, 1953 snake venom (Ophidia: Viperidae)

Se ha estudiado el modo de acción de la miotoxina del veneno de la serpiente Bothrops brazili. La inoculación de la miotoxina en el músculo gastrocnemius de ratones albinos produce durante la primera hora de acción la liberación de creatinina kinasa y lactato deshidrogenasa, mientras que por PAGE-SDS, se revela que la incubación de la miotoxina con músculo gastrocnemius aislado, produce además la liberación de otras proteínas musculares. Asimismo, la miotoxina produce hipercontracción, lesiones delta e incrementa los niveles de calcio intramuscular, tanto in vivo como in vitro, lo cual no depende del ingreso de calcio extracelular vía receptores de dihidropiridina. Este incremento de calcio explicaría la hipercontracción observada y podría generar la activación de proteasa y lipasas endógenas dependientes de calcio, que conducirían a la necrosis muscular.

Aislamiento y caracterización de una miotoxina del veneno de la serpiente Bothrops brazili Hoge. 1953 (Ophidia: Viperidae) / Isolation and characterization of a myotoxin from Bothrops brazili Hoge, 1953 sanke venom (Ophidia: Viperidae)

Se ha purificado una miotoxina del veneno de la serpiente Bathorops brazili, empleando un solo paso cromatográfico de intercambio iónico sobre CM-Sephadex C-50 con buffer acetato de amonio 0,05 M pH 7. La pureza de la proteína fue evaluada por PAGE con y sin SDS, inmunodifusión e inmuelectroforesis. La proteína es de naturaleza básica y contiene 15,6 por ciento de Lys+Arg; además, no está glicosilada, carece de actividad enzimática, y por el método de Lowry se ha calculado que ella constituye el 25 por ciento de la proteína total del veneno. Por PAGE-SDS y cromatografía de filtración, se ha determinado que la miotoxina tiene un peso molecular de 30 KDa, y está formada por 2 cadenas polipeptídicas de 15 KDa cada una. La inoculación de la miotoxina en el músculo gastrocnemius de ratones albinos, produce una severa necrosis del tejido. La miotoxina no tiene actividad hemolítica ni anticoagulante; sin embargo, sí produce edema, se ha calculado una DEM de 32,6 µg de proteína.

Variaciones en la composición proteica, actividades enzimáticas y biológicas del veneno de la serpiente Bothrops atrox (viperidae) en relación con la edad / Variations in the protein composition, enzymatic and biological activities in the venom of Bothrops atrox snake (viperidae) in relation to age

La serpiente Bothrops atrox, que habita en la Selva Amazónica del Perú, es responsable de mayor número de accidentes ofídicos y constituye un problema de salud publica. Por esta razón, se ha realizado un estudio de las variaciones en la composición y actividad del veneno en tres grupos de especímenes en cautiverio, que corresponden a juveniles de 1 y 2 años, así como ejemplares adultos mayores de 5 años. Los venenos obtenidos fueron liofilizados para su conservación y diluidos en concentraciones iniciales de 1 mg/ml en solucion salina o en el buffer apropiado. Con estas muestras se efectuaron los análisis de concentración de proteínas por D. O. 280 nm y por el método de Lowry, determinándose además el número de bandas proteicas por electroforesis en gel poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE_SDS). Con las mismas muestras se hicieron ensayos para medir las siguientes actividades enzimáticas. Caseínolítica, amidolíitca, coagulante, hialuronidasa, L- aminoácido oxidasa (LAO) y fosfolipasa A2. Adicionalmente se determinó la actividad hemorrágica y el efecto edemático con ratones albinos. Los resultados mostraron que la mayor concentración proteica (0,938 mg de proteína / mg de veneno) así como el número máximo de bandas proteicas (8 bandas) se obtuvieron con los venenos de juveniles de 2 años. Asimismo se encontró que algunas actividades enzimáticas como la amidolítica, fosfolipásica y L-aminoácido oxidasa fueron más altas en los juveniles de 2 años, además de los efectos hemorrágico y edemático. En cambio, las actividades coagulante y proteolítica sobre caseína se elevaron progresivamente con la edad de los ejemplares. Sin embargo, la enzima hialunonidasa tuvo su máximo valor en los juveniles de 1 año, decreciendo notablemente en los adultos. Es interesante señalar también que foslolipasa A2 en los adultos sólo tuvo una actividad de 6,4 por ciento con respecto al valor más alto encontrado en el veneno de juveniles de 2 años.

Caracterización parcial del veneno de la serpiente cascabel peruana Crotalus durissus terrificus / Partial characterization of the venom of the peruvian rattlesnake Crotalus durissus terrificus

Se ha investigado el contenido proteico y algunas actividades enzimáticas del veneno de la serpiente cascabel Crotalus durissus terrificus procedente de la región de Sandia, Puno; para ello se empleó el veneno total así como las fracciones obtenidas mediante cromatografía de filtración en Sephadex G-100. El porcentaje de proteína calculado por el método de Lowy fue de 68,6 por ciento para el veneno total; habiéndose obtenido 3 picos de proteína durante el fraccionamiento; en el primero se registró actividad proteolítica, en el segundo, las actividades amidolítica, coagulante y fosfolipasa A2, mientras que en el tercero se detectó otra fracción proteolítica. No se registró la actividad acetilcolinesterasa mientras que la actividad L-aminoácido oxidasa sólo se encontró en el veneno total.

Purificación de una enzima proteolítica del veneno de Bothrops brazili y estudio de su actividad sobre fibrinógeno / Purification of a proteolytic enzyme from the venom of Bothrops brazili snake and study of its activity on fibrinogen

Se ha aislado una enzima proteolítica del veneno de la serpiente peruana brazili, por cromatografía en Sephadex G-100 y CM-Sephadex C-50, con buffer acetato de aminio 0.05 M pH 7,0. La enzima fue purificada 3,2 veces con un rendimiento de 52,5 por ciento y el peso molecular calculado por filtración en gel fue de 18 000, mientras que la PAGES-SDS permitió observar una sola banda proteica de 22 000 daltons en condiciones reductoras y de 20 300 daltons en condiciones no reductoras, determinándose que la enzima es de una sola cadena polipeptídica con al menos un enlace disulfuro. La enzima hidroliza fibrinógeno, fibrina, caseína y albumina, pero no hemoglobina ni mioglobina. Por su acción sobre el fibrinógeno y luego la cadena Bß. Esta actividad es inhibida por EDTA pero no por PMSF, TLCK, iodoacetato y pepstatin, indicando que se trata de una metaloproteinasa; sin embargo, los iones Ca++, Mg++ y Zn++ no restablecen la actividad. Finalmente, la enzima es estable hasta los 45°C y en su acción sobre fibrina, la hidrólisis se da preferencialmente sobre la cadena alfa.

El conejo: un modelo experimental de loxoscelismo cutaneo viscerohemolitico / The rabbit: an experimental model of cutaneous viscerohemolytic loxoscelism

Se envenenaron conejos Nueva Zelanda mediante inyección intradérmica con veneno de la araña casera L. laeta obtenido mediante electroestimulación, a 2 niveles de dosis y los efectos se evaluaron hasta las 48 horas post-inyección del veneno. Los efectos del envenenamiento fueron cutáneos y sistémicos. Los conejos desarrollaron evolutivamente lesiones cutáneas locales de aspectos eritemato-papular, edema hemorragia puntiforme equimosis y necrosis. Los efectos sistemicos incluyeron anemia, leucocitosis, hemoproteínuria, incremento de los niveles plasmáticos de urea y creatinina y muerte. La emisión de orina hemoproteínurica fue observada después de las 9 horas de envenenamiento, correlacionada con la severidad del envenenamiento. La hemoproteína fue caracterizada química y electroforeticamente como hemoglobina. Se analizan los resultados obtenidos con la aplicación de dosis única de lcc endovenoso de suero anti-loxoscélico comercial luego de 4 horas de envenenamiento

Estudios electroforeticos y acción procoagulante del veneno de loxosceles laeta / Electrophoretics studies and procoagulant action of the loxosceles laeta venom

El veneno de arañas adultas Loxósceles laeta fue obtenido mediante electroestimulación y disección glandular. La distribución electroforética de las proteínas del veneno fue obtenida en gel de poliacrilamida a pH 8.6, obteniéndose 19 y 22 bandas proteicas respectivamente. Mediante electroforesis a pH 7.2 en presencia de dodecil sulfato de sodio de sodio se observaron tan solo 18 y 20 respectivamente. Las muestras estudiadas no producen coagulación del fibrinógeno humano, bovino ni plasma humano citratado. El veneno loxoscélico no hidrolizá los substratos BAPna, TAME ni Chromozym TH lo que demuestra la ausencia de Enzima similar a trombina. La presencia de acción procoagulante in vitro del veneno fue demostrada por la aceleración del tiempo de recalcificación del plasma humano. Se discute el rol de esta actividad en el envenenamiento loxoscélico

Contenido proteico y actividades enzimáticas presentes en el veneno de la araña casera - Loxosceles laeta: II Parte / Protein content and enzymatic activities present in the poison of the house spider - Loxosceles laeta: Part II

Se ha investigado el contenido proteico y varias actividades enzimáticas en el veneno de la araña casera Loxosceles laeta. La cantidad de proteína encontrada en 3 de los 4 lotes de arañas en estudio fue de 38 ug por especímen. Asi mismo, se ha encontrado actividad de 5 nucleotidasa, fosfatasa ácida y alcalina, ADPasa y ATPasa, enzima cascinolítica y hialuronidasa. En cambio, no se ha registrado actividad de exonucleasa, endonucleasa, enzima semejante a trombina, enzima fibrinolítica, ni actividad esterásica

Proyecto cooperativo interuniversitario UPCH-UNMSM. Loxoscelismo experimental: aspectos farmacológicos y anatomopatológicos / Interuniversitary cooperative project UPCH-UNMSM. Experimental loxoscelism: pharmacological and anatomopathological aspects

Se obtuvo veneno de arañas Loxosceles sp. procedente de dos localidades del Departamento de Lima (Perú): Urb. Santa María de Chosica y Santa Rosa de Quives (Km. 60). La técnica de estimulación eléctrica para obtención de veneno fue modificado con la finalidad de descartar la contaminación con regurgitado gástrico, obteniéndose 0.33 a 0.76 ul/araña adulta, el que fue utilizado en los ensayos de toxicidad aguda en conejos, y en los estudios bioquímicos. Un segundo método alternativo para la obtención de extractos tóxicos utilizado fue la microdiseccción y homogenización glandular total. La dosis letal media, fue estimado a diferentes intervalos de tiempo, utilizando un programa computarizado del método de transformación en probits. La LD50 intraperitoneal y endovenosa obtenida en ratones, fue de 0.299 y 0.165 glándulas/ratón, respectivamente. Un método de envenenamiento por picadura directa fue desarrollado para el estudio de toxicidad aguda en conejos, y los resultados fueron comparados con los producidos por inyección del veneno obtenido mediante estimulación eléctrica. Los efectos cutáneos del Loxoscelismo en conejos fueron tipificados y biopsias de lesiones en diferentes estadíos evolutivos fueron analizados mediante estudio histológico. El cuadro sistémico en conejos estuvo caracterizado por hemoproteinuria, ausencia de hematuria, lesiones cutáneas variables y muerte. Se determinó la potencia neutralizante in vitro del suero antiloxoscélico comercial (INS, Perú), demostrándose que 0.3ml. del suero, inactivan los efectos letales de una glándula de veneno loxoscélico. Se descarta la probable acción protectora del suero de rata sobre el efecto letal del veneno loxoscélico en el ratón.