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1.
Nat Rev Immunol ; 20(10): 615-632, 2020 10.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32887954

RESUMO

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is the most formidable challenge to humanity in a century. It is widely believed that prepandemic normalcy will never return until a safe and effective vaccine strategy becomes available and a global vaccination programme is implemented successfully. Here, we discuss the immunological principles that need to be taken into consideration in the development of COVID-19 vaccine strategies. On the basis of these principles, we examine the current COVID-19 vaccine candidates, their strengths and potential shortfalls, and make inferences about their chances of success. Finally, we discuss the scientific and practical challenges that will be faced in the process of developing a successful vaccine and the ways in which COVID-19 vaccine strategies may evolve over the next few years.


Assuntos
Anticorpos Antivirais/biossíntese , Betacoronavirus/imunologia , Infecções por Coronavirus/prevenção & controle , Pandemias/prevenção & controle , Pneumonia Viral/prevenção & controle , Síndrome Respiratória Aguda Grave/epidemiologia , Síndrome Respiratória Aguda Grave/prevenção & controle , Vacinas Virais/imunologia , Betacoronavirus/efeitos dos fármacos , Betacoronavirus/patogenicidade , Ensaios Clínicos como Assunto , Infecções por Coronavirus/epidemiologia , Infecções por Coronavirus/imunologia , Infecções por Coronavirus/virologia , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/imunologia , Humanos , Imunidade Coletiva/efeitos dos fármacos , Imunidade Inata/efeitos dos fármacos , Esquemas de Imunização , Imunogenicidade da Vacina , Segurança do Paciente , Pneumonia Viral/epidemiologia , Pneumonia Viral/imunologia , Pneumonia Viral/virologia , Síndrome Respiratória Aguda Grave/imunologia , Síndrome Respiratória Aguda Grave/virologia , Vacinas Atenuadas , Vacinas de DNA , Vacinas de Subunidades , Vacinas de Partículas Semelhantes a Vírus , Vacinas Virais/administração & dosagem , Vacinas Virais/biossíntese
2.
Infect Immun ; 88(11)2020 10 19.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32817331

RESUMO

Group A Streptococcus (GAS) is a human-specific pathogen and major cause of disease worldwide. The molecular pathogenesis of GAS, like many pathogens, is dependent on the coordinated expression of genes encoding different virulence factors. The control of virulence regulator/sensor (CovRS) two-component system is a major virulence regulator of GAS that has been extensively studied. More recent investigations have also involved regulator of Cov (RocA), a regulatory accessory protein to CovRS. RocA interacts, in some manner, with CovRS; however, the precise molecular mechanism is unknown. Here, we demonstrate that RocA is a membrane protein containing seven transmembrane helices with an extracytoplasmically located N terminus and cytoplasmically located C terminus. For the first time, we demonstrate that RocA directly interacts with itself (RocA) and CovS, but not CovR, in intact cells. Single amino acid replacements along the entire length of RocA disrupt RocA-RocA and RocA-CovS interactions to significantly alter the GAS virulence phenotype as defined by secreted virulence factor activity in vitro and tissue destruction and mortality in vivo In summary, we show that single amino acid replacements in a regulatory accessory protein can affect protein-protein interactions to significantly alter the virulence of a major human pathogen.


Assuntos
Proteínas de Bactérias/genética , Fasciite Necrosante/microbiologia , Histidina Quinase/genética , Miosite/microbiologia , Proteínas Repressoras/genética , Infecções Estreptocócicas/microbiologia , Streptococcus pyogenes/genética , Transativadores/genética , Sequência de Aminoácidos , Substituição de Aminoácidos , Animais , Proteínas de Bactérias/química , Proteínas de Bactérias/metabolismo , Sítios de Ligação , Clonagem Molecular , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Fasciite Necrosante/metabolismo , Fasciite Necrosante/mortalidade , Fasciite Necrosante/patologia , Feminino , Expressão Gênica , Regulação Bacteriana da Expressão Gênica , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Histidina Quinase/química , Histidina Quinase/metabolismo , Humanos , Camundongos , Mutação , Miosite/metabolismo , Miosite/mortalidade , Miosite/patologia , Ligação Proteica , Domínios e Motivos de Interação entre Proteínas , Estrutura Secundária de Proteína , Proteínas Repressoras/química , Proteínas Repressoras/metabolismo , Infecções Estreptocócicas/metabolismo , Infecções Estreptocócicas/mortalidade , Infecções Estreptocócicas/patologia , Streptococcus pyogenes/crescimento & desenvolvimento , Streptococcus pyogenes/metabolismo , Streptococcus pyogenes/patogenicidade , Análise de Sobrevida , Transativadores/química , Transativadores/metabolismo , Virulência
3.
Nat Commun ; 11(1): 3834, 2020 07 31.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32737309

RESUMO

The transcriptional inducer anhydrotetracycline (aTc) and the bacteriostatic antibiotic tetracycline (Tc) are commonly used in all fields of biology for control of transcription or translation. A drawback of these and other small molecule inducers is the difficulty of their removal from cell cultures, limiting their application for dynamic control. Here, we describe a simple method to overcome this limitation, and show that the natural photosensitivity of aTc/Tc can be exploited to turn them into highly predictable optogenetic transcriptional- and growth-regulators. This new optogenetic class uniquely features both dynamic and setpoint control which act via population-memory adjustable through opto-chemical modulation. We demonstrate this method by applying it for dynamic gene expression control and for enhancing the performance of an existing optogenetic system. We then expand the utility of the aTc system by constructing a new chemical bandpass filter that increases its aTc response range. The simplicity of our method enables scientists and biotechnologists to use their existing systems employing aTc/Tc for dynamic optogenetic experiments without genetic modification.


Assuntos
Escherichia coli/efeitos dos fármacos , Optogenética/métodos , Biossíntese de Proteínas/efeitos dos fármacos , Inibidores da Síntese de Proteínas/farmacologia , Tetraciclina/farmacologia , Tetraciclinas/farmacologia , Transcrição Genética/efeitos dos fármacos , Clonagem Molecular , Relação Dose-Resposta a Droga , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Expressão Gênica , Genes Reporter , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Proteínas Luminescentes/genética , Proteínas Luminescentes/metabolismo , Fotólise , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Raios Ultravioleta
4.
Nat Commun ; 11(1): 3841, 2020 07 31.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32737323

RESUMO

Histone deacetylases (HDACs) are key enzymes in epigenetics and important drug targets in cancer biology. Whilst it has been established that HDACs regulate many cellular processes, far less is known about the regulation of these enzymes themselves. Here, we show that HDAC8 is allosterically regulated by shifts in populations between exchanging states. An inactive state is identified, which is stabilised by a range of mutations and resembles a sparsely-populated state in equilibrium with active HDAC8. Computational models show that the inactive and active states differ by small changes in a regulatory region that extends up to 28 Å from the active site. The regulatory allosteric region identified here in HDAC8 corresponds to regions in other class I HDACs known to bind regulators, thus suggesting a general mechanism. The presented results pave the way for the development of allosteric HDAC inhibitors and regulators to improve the therapy for several disease states.


Assuntos
Inibidores de Histona Desacetilases/química , Histona Desacetilases/química , Ácidos Hidroxâmicos/química , Indóis/química , Proteínas Repressoras/química , Vorinostat/química , Regulação Alostérica , Sítio Alostérico , Domínio Catalítico , Clonagem Molecular , Cristalografia por Raios X , Ativação Enzimática , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Expressão Gênica , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Inibidores de Histona Desacetilases/metabolismo , Histona Desacetilases/genética , Histona Desacetilases/metabolismo , Humanos , Ácidos Hidroxâmicos/metabolismo , Indóis/metabolismo , Simulação de Dinâmica Molecular , Mutação , Ligação Proteica , Conformação Proteica em alfa-Hélice , Conformação Proteica em Folha beta , Domínios e Motivos de Interação entre Proteínas , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Proteínas Repressoras/antagonistas & inibidores , Proteínas Repressoras/genética , Proteínas Repressoras/metabolismo , Especificidade por Substrato , Termodinâmica , Vorinostat/metabolismo
5.
PLoS Biol ; 18(8): e3000790, 2020 08.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32776918

RESUMO

Concentrative nucleoside transporters (CNTs), members of the solute carrier (SLC) 28 transporter family, facilitate the salvage of nucleosides and therapeutic nucleoside derivatives across the plasma membrane. Despite decades of investigation, the structures of human CNTs remain unknown. We determined the cryogenic electron microscopy (cryo-EM) structure of human CNT (hCNT) 3 at an overall resolution of 3.6 Å. As with its bacterial homologs, hCNT3 presents a trimeric architecture with additional N-terminal transmembrane helices to stabilize the conserved central domains. The conserved binding sites for the substrate and sodium ions unravel the selective nucleoside transport and distinct coupling mechanism. Structural comparison of hCNT3 with bacterial homologs indicates that hCNT3 is stabilized in an inward-facing conformation. This study provides the molecular determinants for the transport mechanism of hCNTs and potentially facilitates the design of nucleoside drugs.


Assuntos
Proteínas de Bactérias/química , Proteínas de Membrana Transportadoras/química , Uridina/química , Animais , Proteínas de Bactérias/genética , Proteínas de Bactérias/metabolismo , Baculoviridae/genética , Baculoviridae/metabolismo , Sítios de Ligação , Transporte Biológico , Clonagem Molecular , Microscopia Crioeletrônica , Expressão Gênica , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Humanos , Proteínas de Membrana Transportadoras/genética , Proteínas de Membrana Transportadoras/metabolismo , Modelos Moleculares , Ligação Proteica , Conformação Proteica em alfa-Hélice , Domínios e Motivos de Interação entre Proteínas , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Células Sf9 , Spodoptera , Homologia Estrutural de Proteína , Especificidade por Substrato , Uridina/metabolismo
6.
PLoS Biol ; 18(8): e3000851, 2020 08.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32822389

RESUMO

High levels of the amyloid-beta (Aß) peptide have been shown to disrupt neuronal function and induce hyperexcitability, but it is unclear what effects Aß-associated hyperexcitability may have on tauopathy pathogenesis or propagation in vivo. Using a novel transgenic mouse line to model the impact of human APP (hAPP)/Aß accumulation on tauopathy in the entorhinal cortex-hippocampal (EC-HIPP) network, we demonstrate that hAPP overexpression aggravates EC-Tau aggregation and accelerates pathological tau spread into the hippocampus. In vivo recordings revealed a strong role for hAPP/Aß, but not tau, in the emergence of EC neuronal hyperactivity and impaired theta rhythmicity. Chronic chemogenetic attenuation of EC neuronal hyperactivity led to reduced hAPP/Aß accumulation and reduced pathological tau spread into downstream hippocampus. These data strongly support the hypothesis that in Alzheimer's disease (AD), Aß-associated hyperactivity accelerates the progression of pathological tau along vulnerable neuronal circuits, and demonstrates the utility of chronic, neuromodulatory approaches in ameliorating AD pathology in vivo.


Assuntos
Doença de Alzheimer/genética , Precursor de Proteína beta-Amiloide/genética , Córtex Entorrinal/metabolismo , Tauopatias/genética , Proteínas tau/genética , Potenciais de Ação/fisiologia , Doença de Alzheimer/metabolismo , Doença de Alzheimer/patologia , Doença de Alzheimer/terapia , Precursor de Proteína beta-Amiloide/metabolismo , Animais , Proteína Quinase Tipo 2 Dependente de Cálcio-Calmodulina/genética , Proteína Quinase Tipo 2 Dependente de Cálcio-Calmodulina/metabolismo , Dependovirus/genética , Dependovirus/metabolismo , Modelos Animais de Doenças , Eletrodos Implantados , Córtex Entorrinal/patologia , Feminino , Regulação da Expressão Gênica , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Hipocampo/metabolismo , Hipocampo/patologia , Humanos , Masculino , Camundongos , Camundongos Endogâmicos C57BL , Camundongos Transgênicos , Neurônios/metabolismo , Neurônios/patologia , Agregados Proteicos , Técnicas Estereotáxicas , Tauopatias/metabolismo , Tauopatias/patologia , Tauopatias/terapia , Ritmo Teta/fisiologia , Transdução Genética , Transgenes , Proteínas tau/metabolismo
7.
Virus Res ; 288: 198114, 2020 10 15.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32800805

RESUMO

The current COVID-19 pandemic has urged the scientific community internationally to find answers in terms of therapeutics and vaccines to control SARS-CoV-2. Published investigations mostly on SARS-CoV and to some extent on MERS has taught lessons on vaccination strategies to this novel coronavirus. This is attributed to the fact that SARS-CoV-2 uses the same receptor as SARS-CoV on the host cell i.e. human Angiotensin Converting Enzyme 2 (hACE2) and is approximately 79% similar genetically to SARS-CoV. Though the efforts on COVID-19 vaccines started very early, initially in China, as soon as the outbreak of novel coronavirus erupted and then world-over as the disease was declared a pandemic by WHO. But we will not be having an effective COVID-19 vaccine before September, 2020 as per very optimistic estimates. This is because a successful COVID-19 vaccine will require a cautious validation of efficacy and adverse reactivity as the target vaccinee population include high-risk individuals over the age of 60, particularly those with chronic co-morbid conditions, frontline healthcare workers and those involved in essentials industries. Various platforms for vaccine development are available namely: virus vectored vaccines, protein subunit vaccines, genetic vaccines, and monoclonal antibodies for passive immunization which are under evaluations for SARS-CoV-2, with each having discrete benefits and hindrances. The COVID-19 pandemic which probably is the most devastating one in the last 100 years after Spanish flu mandates the speedy evaluation of the multiple approaches for competence to elicit protective immunity and safety to curtail unwanted immune-potentiation which plays an important role in the pathogenesis of this virus. This review is aimed at providing an overview of the efforts dedicated to an effective vaccine for this novel coronavirus which has crippled the world in terms of economy, human health and life.


Assuntos
Anticorpos Antivirais/biossíntese , Betacoronavirus/imunologia , Infecções por Coronavirus/prevenção & controle , Pandemias/prevenção & controle , Pneumonia Viral/prevenção & controle , Vacinas Virais/imunologia , Betacoronavirus/efeitos dos fármacos , Betacoronavirus/patogenicidade , Ensaios Clínicos como Assunto , Infecções por Coronavirus/epidemiologia , Infecções por Coronavirus/imunologia , Infecções por Coronavirus/terapia , Infecções por Coronavirus/virologia , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/imunologia , Humanos , Imunidade Inata/efeitos dos fármacos , Imunização Passiva/métodos , Imunogenicidade da Vacina , Segurança do Paciente , Peptidil Dipeptidase A/genética , Peptidil Dipeptidase A/imunologia , Peptidil Dipeptidase A/metabolismo , Pneumonia Viral/epidemiologia , Pneumonia Viral/imunologia , Pneumonia Viral/virologia , Receptores Virais/genética , Receptores Virais/imunologia , Receptores Virais/metabolismo , Vacinas Atenuadas , Vacinas de DNA , Vacinas de Subunidades , Vacinas de Partículas Semelhantes a Vírus/administração & dosagem , Vacinas de Partículas Semelhantes a Vírus/biossíntese , Vacinas de Partículas Semelhantes a Vírus/imunologia , Vacinas Virais/administração & dosagem , Vacinas Virais/biossíntese
8.
Arch Virol ; 165(10): 2301-2309, 2020 Oct.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32757056

RESUMO

Porcine circovirus type 2 (PCV2) is a major pathogen associated with swine diseases. It is the smallest single-stranded DNA virus, and its genome contains four major open reading frames (ORFs). ORF2 encodes the major structural protein Cap, which can self-assemble into virus-like particles (VLPs) in vitro and contains the primary antigenic determinants. In this study, we developed a high-efficiency method for obtaining VLPs and optimized the purification conditions. In this method, we expressed the protein Cap with a 6× His tag using baculovirus-infected silkworm larvae as well as the E. coli BL21(DE3) prokaryotic expression system. The PCV2 Cap proteins produced by the silkworm larvae and E. coli BL21(DE3) were purified. Cap proteins purified from silkworm larvae self-assembled into VLPs in vitro, while the Cap proteins purified from bacteria were unable to self-assemble. Transmission electron microscopy confirmed the self-assembly of VLPs. The immunogenicity of the VLPs produced using the baculovirus system was demonstrated using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the purification process was optimized. The results demonstrated that the expression system using baculovirus-infected silkworm larvae is a good choice for obtaining VLPs of PCV2 and has potential for the development of a low-cost and efficient vaccine.


Assuntos
Anticorpos Antivirais/biossíntese , Baculoviridae/genética , Bombyx/virologia , Proteínas do Capsídeo/imunologia , Circovirus/imunologia , Vacinas de Partículas Semelhantes a Vírus/biossíntese , Vacinas Virais/biossíntese , Animais , Antígenos Virais/química , Antígenos Virais/imunologia , Baculoviridae/imunologia , Proteínas do Capsídeo/biossíntese , Proteínas do Capsídeo/genética , Infecções por Circoviridae/imunologia , Infecções por Circoviridae/prevenção & controle , Infecções por Circoviridae/virologia , Circovirus/genética , Epitopos/química , Epitopos/imunologia , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Feminino , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Histidina/genética , Histidina/imunologia , Soros Imunes/química , Imunogenicidade da Vacina , Larva/virologia , Camundongos , Oligopeptídeos/genética , Oligopeptídeos/imunologia , Proteínas Recombinantes de Fusão/biossíntese , Proteínas Recombinantes de Fusão/genética , Proteínas Recombinantes de Fusão/imunologia , Suínos , Doenças dos Suínos/imunologia , Doenças dos Suínos/prevenção & controle , Doenças dos Suínos/virologia , Vacinas de Partículas Semelhantes a Vírus/administração & dosagem , Vacinas de Partículas Semelhantes a Vírus/genética , Vacinas de Partículas Semelhantes a Vírus/isolamento & purificação , Vacinas Virais/administração & dosagem , Vacinas Virais/genética , Vacinas Virais/isolamento & purificação
9.
Virus Res ; 288: 198141, 2020 10 15.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32846196

RESUMO

The recent outbreak of the betacoronavirus SARS-CoV-2 has become a significant concern to public health care worldwide. As of August 19, 2020, more than 22,140,472 people are infected, and over 781,135 people have died due to this deadly virus. In the USA alone, over 5,482,602 people are currently infected, and more than 171,823 people have died. SARS-CoV-2 has shown a higher infectivity rate and a more extended incubation period as compared to previous coronaviruses. SARS-CoV-2 binds much more strongly than SARS-CoV to the same host receptor, angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). Previously, several methods to develop a vaccine against SARS-CoV or MERS-CoV have been tried with limited success. Since SARS-CoV-2 uses the spike (S) protein for entry to the host cell, it is one of the most preferred targets for making vaccines or therapeutics against SARS-CoV-2. In this review, we have summarised the characteristics of the S protein, as well as the different approaches being used for the development of vaccines and/or therapeutics based on the S protein.


Assuntos
Anticorpos Antivirais/biossíntese , Betacoronavirus/imunologia , Infecções por Coronavirus/prevenção & controle , Pandemias/prevenção & controle , Pneumonia Viral/prevenção & controle , Glicoproteína da Espícula de Coronavírus/imunologia , Vacinas Virais/imunologia , Anticorpos Facilitadores/efeitos dos fármacos , Betacoronavirus/efeitos dos fármacos , Betacoronavirus/patogenicidade , Ensaios Clínicos como Assunto , Infecções por Coronavirus/epidemiologia , Infecções por Coronavirus/imunologia , Infecções por Coronavirus/virologia , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/imunologia , Humanos , Imunogenicidade da Vacina , Segurança do Paciente , Peptidil Dipeptidase A/genética , Peptidil Dipeptidase A/imunologia , Peptidil Dipeptidase A/metabolismo , Pneumonia Viral/epidemiologia , Pneumonia Viral/imunologia , Pneumonia Viral/virologia , Receptores Virais/genética , Receptores Virais/imunologia , Receptores Virais/metabolismo , Glicoproteína da Espícula de Coronavírus/genética , Glicoproteína da Espícula de Coronavírus/metabolismo , Vacinas Atenuadas , Vacinas de DNA , Vacinas de Subunidades , Vacinas de Partículas Semelhantes a Vírus/administração & dosagem , Vacinas de Partículas Semelhantes a Vírus/biossíntese , Vacinas de Partículas Semelhantes a Vírus/imunologia , Vacinas Virais/administração & dosagem , Vacinas Virais/biossíntese
11.
Biochim Biophys Acta Proteins Proteom ; 1868(8): 140442, 2020 08.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32376478

RESUMO

d-Aspartate oxidase (DDO) is a flavin adenine dinucleotide (FAD)-containing flavoprotein that stereospecifically acts on acidic d-amino acids (i.e., free d-aspartate and d-glutamate). Mammalian DDO, which exhibits higher activity toward d-aspartate than d-glutamate, is presumed to regulate levels of d-aspartate in the body and is not thought to degrade d-glutamate in vivo. By contrast, three DDO isoforms are present in the nematode Caenorhabditis elegans, DDO-1, DDO-2, and DDO-3, all of which exhibit substantial activity toward d-glutamate as well as d-aspartate. In this study, we optimized the Escherichia coli culture conditions for production of recombinant C. elegans DDO-1, purified the protein, and showed that it is a flavoprotein with a noncovalently but tightly attached FAD. Furthermore, C. elegans DDO-1, but not mammalian (rat) DDO, efficiently and selectively degraded d-glutamate in addition to d-aspartate, even in the presence of various other amino acids. Thus, C. elegans DDO-1 might be a useful tool for determining these acidic d-amino acids in biological samples.


Assuntos
Proteínas de Caenorhabditis elegans/química , Caenorhabditis elegans/química , D-Aspartato Oxidase/química , Ácido D-Aspártico/química , Flavina-Adenina Dinucleotídeo/química , Ácido Glutâmico/química , Animais , Caenorhabditis elegans/enzimologia , Proteínas de Caenorhabditis elegans/genética , Proteínas de Caenorhabditis elegans/metabolismo , Clonagem Molecular , D-Aspartato Oxidase/genética , D-Aspartato Oxidase/metabolismo , Ácido D-Aspártico/metabolismo , Ensaios Enzimáticos , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Flavina-Adenina Dinucleotídeo/metabolismo , Expressão Gênica , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Ácido Glutâmico/metabolismo , Isoenzimas/química , Isoenzimas/genética , Isoenzimas/metabolismo , Cinética , Ratos , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Especificidade da Espécie , Especificidade por Substrato
12.
Nat Chem Biol ; 16(7): 783-790, 2020 07.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32393899

RESUMO

Leukotrienes (LT) are lipid mediators of the inflammatory response that are linked to asthma and atherosclerosis. LT biosynthesis is initiated by 5-lipoxygenase (5-LOX) with the assistance of the substrate-binding 5-LOX-activating protein at the nuclear membrane. Here, we contrast the structural and functional consequences of the binding of two natural product inhibitors of 5-LOX. The redox-type inhibitor nordihydroguaiaretic acid (NDGA) is lodged in the 5-LOX active site, now fully exposed by disordering of the helix that caps it in the apo-enzyme. In contrast, the allosteric inhibitor 3-acetyl-11-keto-beta-boswellic acid (AKBA) from frankincense wedges between the membrane-binding and catalytic domains of 5-LOX, some 30 Å from the catalytic iron. While enzyme inhibition by NDGA is robust, AKBA promotes a shift in the regiospecificity, evident in human embryonic kidney 293 cells and in primary immune cells expressing 5-LOX. Our results suggest a new approach to isoform-specific 5-LOX inhibitor development through exploitation of an allosteric site in 5-LOX.


Assuntos
Araquidonato 5-Lipoxigenase/química , Produtos Biológicos/química , Inibidores de Lipoxigenase/química , Masoprocol/química , Triterpenos/química , Sítio Alostérico , Araquidonato 5-Lipoxigenase/genética , Araquidonato 5-Lipoxigenase/metabolismo , Produtos Biológicos/metabolismo , Domínio Catalítico , Clonagem Molecular , Cristalografia por Raios X , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Expressão Gênica , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Humanos , Ácidos Hidroxieicosatetraenoicos/química , Ácidos Hidroxieicosatetraenoicos/metabolismo , Leucotrieno B4/química , Leucotrieno B4/metabolismo , Inibidores de Lipoxigenase/metabolismo , Masoprocol/metabolismo , Modelos Moleculares , Ligação Proteica , Conformação Proteica em alfa-Hélice , Conformação Proteica em Folha beta , Domínios e Motivos de Interação entre Proteínas , Multimerização Proteica , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Especificidade por Substrato , Triterpenos/metabolismo
13.
Virology ; 546: 127-132, 2020 07.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32452411

RESUMO

Adeno-associated virus (AAV) is one of the most researched, clinically utilized gene therapy vectors. Though clinical success has been achieved, transgene delivery and expression may be hindered by cellular and tissue barriers. Understanding the role of receptor binding, entry, endosomal escape, cytoplasmic and nuclear trafficking, capsid uncoating, and viral transcription in therapeutic efficacy is paramount. Previous studies have shown that N-terminal regions of the AAV capsid proteins are responsible for endosomal escape and nuclear trafficking, however the mechanisms remain unknown. We identified a highly-conserved three-residue serine/threonine (S/T) motif in the capsid N-terminus, previously uncharacterized in its role in intracellular trafficking and transduction. Using alanine scanning mutagenesis, we found S155 and the flanking residues, D154 and G158, are essential for AAV2 transduction efficiency. Remarkably, specific capsid mutants show a 5 to 9-fold decrease in viral mRNA transcripts, highlighting a potential role of the S/T motif in transcription of the viral genome.


Assuntos
Proteínas do Capsídeo/química , Proteínas do Capsídeo/metabolismo , Dependovirus/genética , Regulação Viral da Expressão Gênica , Motivos de Aminoácidos , Proteínas do Capsídeo/genética , Dependovirus/química , Dependovirus/fisiologia , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/genética , Vetores Genéticos/fisiologia , Humanos , Montagem de Vírus , Replicação Viral
14.
Nat Chem Biol ; 16(7): 776-782, 2020 07.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32367018

RESUMO

In type II polyketide synthases (PKSs), the ketosynthase-chain length factor (KS-CLF) complex catalyzes polyketide chain elongation with the acyl carrier protein (ACP). Highly reducing type II PKSs, represented by IgaPKS, produce polyene structures instead of the well-known aromatic skeletons. Here, we report the crystal structures of the Iga11-Iga12 (KS-CLF) heterodimer and the covalently cross-linked Iga10=Iga11-Iga12 (ACP=KS-CLF) tripartite complex. The latter structure revealed the molecular basis of the interaction between Iga10 and Iga11-Iga12, which differs from that between the ACP and KS of Escherichia coli fatty acid synthase. Furthermore, the reaction pocket structure and site-directed mutagenesis revealed that the negative charge of Asp 113 of Iga11 prevents further condensation using a ß-ketoacyl product as a substrate, which distinguishes IgaPKS from typical type II PKSs. This work will facilitate the future rational design of PKSs.


Assuntos
Proteína de Transporte de Acila/química , Proteínas de Escherichia coli/química , Escherichia coli/enzimologia , Ácido Graxo Sintases/química , Policetídeo Sintases/química , Policetídeos/química , Proteína de Transporte de Acila/genética , Proteína de Transporte de Acila/metabolismo , Biocatálise , Domínio Catalítico , Clonagem Molecular , Cristalografia por Raios X , Escherichia coli/genética , Proteínas de Escherichia coli/genética , Proteínas de Escherichia coli/metabolismo , Ácido Graxo Sintases/genética , Ácido Graxo Sintases/metabolismo , Expressão Gênica , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Modelos Moleculares , Mutagênese Sítio-Dirigida , Policetídeo Sintases/genética , Policetídeo Sintases/metabolismo , Policetídeos/metabolismo , Ligação Proteica , Conformação Proteica em alfa-Hélice , Conformação Proteica em Folha beta , Domínios e Motivos de Interação entre Proteínas , Multimerização Proteica , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Streptomyces/enzimologia , Streptomyces/genética , Especificidade por Substrato
15.
Protein Sci ; 29(7): 1596-1605, 2020 07.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32304108

RESUMO

Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is rapidly spreading around the world. There is no existing vaccine or proven drug to prevent infections and stop virus proliferation. Although this virus is similar to human and animal SARS-CoVs and Middle East Respiratory Syndrome coronavirus (MERS-CoVs), the detailed information about SARS-CoV-2 proteins structures and functions is urgently needed to rapidly develop effective vaccines, antibodies, and antivirals. We applied high-throughput protein production and structure determination pipeline at the Center for Structural Genomics of Infectious Diseases to produce SARS-CoV-2 proteins and structures. Here we report two high-resolution crystal structures of endoribonuclease Nsp15/NendoU. We compare these structures with previously reported homologs from SARS and MERS coronaviruses.


Assuntos
Betacoronavirus/química , Endorribonucleases/química , Coronavírus da Síndrome Respiratória do Oriente Médio/química , Oligonucleotídeos/química , Vírus da SARS/química , Proteínas não Estruturais Virais/química , Sequência de Aminoácidos , Betacoronavirus/genética , Betacoronavirus/metabolismo , Domínio Catalítico , Clonagem Molecular , Cristalografia por Raios X , Endorribonucleases/genética , Endorribonucleases/metabolismo , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Expressão Gênica , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Humanos , Coronavírus da Síndrome Respiratória do Oriente Médio/genética , Coronavírus da Síndrome Respiratória do Oriente Médio/metabolismo , Modelos Moleculares , Oligonucleotídeos/metabolismo , Ligação Proteica , Conformação Proteica em alfa-Hélice , Conformação Proteica em Folha beta , Domínios e Motivos de Interação entre Proteínas , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Vírus da SARS/genética , Vírus da SARS/metabolismo , Alinhamento de Sequência , Homologia de Sequência de Aminoácidos , Especificidade por Substrato , Proteínas não Estruturais Virais/genética , Proteínas não Estruturais Virais/metabolismo
16.
Biochim Biophys Acta Proteins Proteom ; 1868(8): 140437, 2020 08.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32325255

RESUMO

The endo-ß-1,4-mannanase from the hyperthermostable bacterium Thermotoga petrophila (TpMan) is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of mannan and heteromannan polysaccharides. Of the three domains that comprise TpMan, the N-terminal GH5 catalytic domain and the C-terminal carbohydrate-binding domain are connected through a central ancillary domain of unknown structure and function. In this study, we report the partial crystal structure of the TpMan at 1.45 Å resolution, so far, the first modular hyperthermostable endo-ß-1,4-mannanase structure determined. The structure exhibits two domains, a (ß/α)8-barrel GH5 catalytic domain connected via a linker to the central domain with an immunoglobulin-like ß-sandwich fold formed of seven ß-strands. Functional analysis showed that whereas the immunoglobulin-like domain does not have the carbohydrate-binding function, it stacks on the GH5 catalytic domain acting as a thermostabilizing domain and allowing operation at hyperthermophilic conditions. The carbohydrate-binding domain is absent in the crystal structure most likely due to its high flexibility around the immunoglobulin-like domain which may act also as a pivot. These results represent new structural and functional information useful on biotechnological applications for biofuel and food industries.


Assuntos
Bactérias/química , Proteínas de Bactérias/química , Domínios de Imunoglobulina , Mananas/química , Manosidases/química , Bactérias/enzimologia , Proteínas de Bactérias/genética , Proteínas de Bactérias/metabolismo , Domínio Catalítico , Clonagem Molecular , Cristalografia por Raios X , Estabilidade Enzimática , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Expressão Gênica , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Hidrólise , Interações Hidrofóbicas e Hidrofílicas , Mananas/metabolismo , Manosidases/genética , Manosidases/metabolismo , Modelos Moleculares , Ligação Proteica , Conformação Proteica em alfa-Hélice , Conformação Proteica em Folha beta , Domínios e Motivos de Interação entre Proteínas , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Especificidade por Substrato
17.
Adv Virus Res ; 106: 39-84, 2020.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32327148

RESUMO

Adeno-associated virus (AAV) is a nonenveloped, ssDNA virus in the parvovirus family, which has become one of the leading candidate vectors for human gene therapy. AAV has been studied extensively to identify host cellular factors involved in infection, as well as to identify capsid variants that confer clinically favorable transduction profiles ex vivo and in vivo. Recent advances in technology have allowed for direct genetic approaches to be used to more comprehensively characterize host factors required for AAV infection and allowed for identification of a critical multi-serotype receptor, adeno-associated virus receptor (AAVR). In this chapter, we will discuss the interactions of AAV with its glycan and proteinaceous receptors and describe the host and viral components involved in AAV entry, which requires cellular attachment, endocytosis, trafficking to the trans-Golgi network and nuclear import. AAV serves as a paradigm for entry of nonenveloped viruses. Furthermore, we will discuss the potential of utilizing our increased understanding of virus-host interactions during AAV entry to develop better AAV-based therapeutics, with a focus on host factors and capsid interactions involved in in vivo tropism.


Assuntos
Dependovirus/fisiologia , Ligação Viral , Internalização do Vírus , Animais , Dependovirus/química , Dependovirus/genética , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/genética , Vetores Genéticos/fisiologia , Humanos , Infecções por Parvoviridae/genética , Infecções por Parvoviridae/metabolismo , Infecções por Parvoviridae/virologia , Receptores Virais/genética , Receptores Virais/metabolismo
18.
Nat Chem Biol ; 16(7): 756-765, 2020 07.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32284601

RESUMO

Soluble prion proteins contingently encounter foreign prion aggregates, leading to cross-species prion transmission. However, how its efficiency is regulated by structural fluctuation of the host soluble prion protein remains unsolved. In the present study, through the use of two distantly related yeast prion Sup35 proteins, we found that a specific conformation of a short disordered segment governs interspecies prion transmissibility. Using a multidisciplinary approach including high-resolution NMR and molecular dynamics simulation, we identified critical residues within this segment that allow interspecies prion transmission in vitro and in vivo, by locally altering dynamics and conformation of soluble prion proteins. Remarkably, subtle conformational differences caused by a methylene group between asparagine and glutamine sufficed to change the short segment structure and substantially modulate the cross-seeding activity. Thus, our findings uncover how conformational dynamics of the short segment in the host prion protein impacts cross-species prion transmission. More broadly, our study provides mechanistic insights into cross-seeding between heterologous proteins.


Assuntos
Asparagina/química , Glutamina/química , Proteínas Intrinsicamente Desordenadas/química , Fatores de Terminação de Peptídeos/química , Príons/química , Proteínas de Saccharomyces cerevisiae/química , Saccharomyces cerevisiae/genética , Sequência de Aminoácidos , Asparagina/metabolismo , Clonagem Molecular , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Expressão Gênica , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Glutamina/metabolismo , Proteínas Intrinsicamente Desordenadas/genética , Proteínas Intrinsicamente Desordenadas/metabolismo , Simulação de Dinâmica Molecular , Fatores de Terminação de Peptídeos/genética , Fatores de Terminação de Peptídeos/metabolismo , Príons/genética , Príons/metabolismo , Domínios e Motivos de Interação entre Proteínas , Isoformas de Proteínas/química , Isoformas de Proteínas/genética , Isoformas de Proteínas/metabolismo , Estrutura Secundária de Proteína , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Saccharomyces cerevisiae/metabolismo , Proteínas de Saccharomyces cerevisiae/genética , Proteínas de Saccharomyces cerevisiae/metabolismo , Alinhamento de Sequência , Homologia de Sequência de Aminoácidos , Termodinâmica
19.
Hum Genet ; 139(10): 1233-1246, 2020 Oct.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32277284

RESUMO

Approximately 3% of the human genome is composed of short tandem repeat (STR) DNA sequence known as microsatellites, which can be found in both coding and non-coding regions. When associated with genic regions, expansion of microsatellite repeats beyond a critical threshold causes dozens of neurological repeat expansion disorders. To better understand the molecular pathology of repeat expansion disorders, precise cloning of microsatellite repeat sequence and expansion size is highly valuable. Unfortunately, cloning repeat expansions is often challenging and presents a significant bottleneck to practical investigation. Here, we describe a clear method for seamless and systematic cloning of practically any microsatellite repeat expansion. We use cloning and expansion of GGGGCC repeats, which are the leading genetic cause of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD), as an example. We employ a recursive directional ligation (RDL) technique to build multiple GGGGCC repeat-containing vectors. We describe methods to validate repeat expansion cloning, including diagnostic restriction digestion, PCR across the repeat, and next-generation long-read MinION nanopore sequencing. Validated cloning of microsatellite repeats beyond the critical expansion threshold can facilitate step-by-step characterization of disease mechanisms at the cellular and molecular level.


Assuntos
Esclerose Amiotrófica Lateral/genética , Proteína C9orf72/genética , Clonagem Molecular/métodos , Expansão das Repetições de DNA , Demência Frontotemporal/genética , Repetições de Microssatélites , Esclerose Amiotrófica Lateral/metabolismo , Esclerose Amiotrófica Lateral/patologia , Sequência de Bases , Proteína C9orf72/metabolismo , Enzimas de Restrição do DNA/química , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Demência Frontotemporal/metabolismo , Demência Frontotemporal/patologia , Expressão Gênica , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Genoma Humano , Genótipo , Sequenciamento de Nucleotídeos em Larga Escala , Humanos , Reação em Cadeia da Polimerase/métodos , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/metabolismo
20.
Sci Adv ; 6(10): eaaz2309, 2020 03.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-32181363

RESUMO

Adenine base editors, which were developed by engineering a transfer RNA adenosine deaminase enzyme (TadA) into a DNA editing enzyme (TadA*), enable precise modification of A:T to G⋮C base pairs. Here, we use molecular dynamics simulations to uncover the structural and functional roles played by the initial mutations in the onset of the DNA editing activity by TadA*. Atomistic insights reveal that early mutations lead to intricate conformational changes in the structure of TadA*. In particular, the first mutation, Asp108Asn, induces an enhancement in the binding affinity of TadA to DNA. In silico and in vivo reversion analyses verify the importance of this single mutation in imparting functional promiscuity to TadA* and demonstrate that TadA* performs DNA base editing as a monomer rather than a dimer.


Assuntos
Desaminases APOBEC/química , Adenina/metabolismo , Adenosina Desaminase/química , DNA de Cadeia Simples/química , DNA/química , Proteínas de Escherichia coli/química , Edição de Genes/métodos , Desaminases APOBEC/genética , Desaminases APOBEC/metabolismo , Adenosina Desaminase/genética , Adenosina Desaminase/metabolismo , Sítios de Ligação , Clonagem Molecular , DNA/genética , DNA/metabolismo , DNA de Cadeia Simples/genética , DNA de Cadeia Simples/metabolismo , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Proteínas de Escherichia coli/genética , Proteínas de Escherichia coli/metabolismo , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Células HEK293 , Humanos , Cinética , Simulação de Dinâmica Molecular , Mutação , Conformação de Ácido Nucleico , Ligação Proteica , Conformação Proteica em alfa-Hélice , Conformação Proteica em Folha beta , Domínios e Motivos de Interação entre Proteínas , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Especificidade por Substrato , Termodinâmica
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