Normalización de un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para la cuantificación de papilomavirus humano de alto riesgo oncogénico / Standardization of a real-time based polymerase chain reaction system for the quantification of human papilomavirus of high oncogenic risk

RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue normalizar e implementar un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, para determinar la carga viral de 7 genotipos de papilomavirus humano (PVH) de alto riesgo oncogénico. Se evaluó la especificidad del sistema y se construyeron las curvas estándar para PVH 16 y 18, que se emplearon para la cuantificación de ADN viral en diferentes muestras de pacientes identificados como positivos a PVH, mediante reacción en cadena de la polimerasa (RCP) cualitativa y secuenciación nucleotídica. Se obtuvieron dos curvas estándar para PVH 16 y 18, a partir del ADN genómico de las líneas celulares SiHa y HeLa, las que mostraron una buena correlación lineal ( r = -0,99) y valores bajos de error. El límite inferior de detección a partir del ADN de las líneas celulares fue de hasta 10 copias para ambos genotipos. No se obtuvo reacción cruzada entre los diferentes tipos de PVH ni con otros virus ADN. La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RCP-TR) normalizada probó ser un sistema simple, rápido, específico y altamente sensible. Además, permitirá desarrollar investigaciones sobre la prevalencia de infección por PVH en Cuba, con vistas a la aplicación de las vacunas que se encuentran disponibles en el mercado internacional, así como la evaluación de otros candidatos vacunales diseñados en el futuro(AU)

ABSTRACT

The objective of the present study is to standardize a real-time based polymerase chain reaction system in order to detect and quantify 7 high risk human papillomavirus in different clinical samples from patients suspected of this type of infection. The validation of a 5´ exonuclease fluorescent probe real-time PCR assay (TaqMan format) for the detection and quantification of the 7 most frequent HR-HPV types (16, 18, 31, 33, 45, and 58) which account for over 87% of cervical carcinomas world-wide was carried out. Simultaneous PCR reactions are required to detect the designated HPV types. Specificity tests for each HPV type and other DNA viruses were performed. Standard external curve constructions were achieved, which allow determining the number of target DNA copies in the previously HPV tested samples. HPV 16 and 18 standard curves were obtained from purified genomic DNA of SiHa and HeLa cell lines, respectively. The pattern curves were constructed on the basis of each of the resulting standard DNA, which showed good linear correlation (r = -0, 99) and low error values. The lower detection limit was 10 copies for both HPV 16 and 18. No cross reactions between HPV types and other DNA viruses were observed. Real-Time Polymerase Chain Reaction system, standardized for 7 HPV types, proved to be a rapid, specific and highly sensitive system for better diagnosis and follow-up of patients with high grade intraepithelial lesions. In addition, this assay will allow the development of coming researches in relation with the prevalence and pathogenesis of human papillomavirus infections in different samples from Cuban patients(AU)