Identification of medically important yeasts by sequence analysis of the internal transcribed spacer and D1/D2 region of the large ribosomal subunit / Identificación de levaduras de interés médico mediante análisis de secuencia del espaciador interno transcrito y de la región D1/D2 de la subunidad ribosómica grande

ABSTRACT

Background: The prevalence of opportunistic yeast infections has increased in recent decades as the result of an increasing immunocompromised patient population. Aims: To evaluate ribosomal RNA (rRNA) gene sequence to identify medically important yeast species, to investigate the performance of both the rRNA gene internal transcribed spacer (ITS) and D1/D2 region in identifying clinically relevant yeasts, and to compare these results with those of a standard phenotypic method. Methods: Both regions from 50 yeast strains, comprising 45 clinical isolates and 5 reference strains, were amplified using PCR and then sequenced. The sequences were compared to reference data available from the GenBank database of the National Center for Biotechnology Information using the BLASTn tool. Results: Using ID32C, 88% (44/50) of all strains were identified accurately at the species level, although 6% were misidentified; two Candida eremophila isolates were identified as Candida glabrata and Candida tropicalis, and one Saprochaete clavata isolate was identified as Saprochaete capitata. Two of the four isolates identified by phenotypic methods as Trichosporon asahii were defined so by analyzing the ITS region, but the remaining two were not distinguishable from closely related species. Based on the D1/D2 region, these four isolates had 100% sequence identity with T. asahii, Trichosporon japonicum, and Trichosporon asteroides. The isolate identified as Trichosporon inkin using ID32C could not be distinguished from Trichosporon ovoides by analyzing the ITS and D1/D2 regions. Conclusions: Identifying medically important yeasts by sequencing the ITS and D1/D2 region is a rapid and reliable alternative to conventional identification methods. For a diagnostic algorithm, we suggest a two-step procedure integrating conventional methods (e.g. microscopic morphology on corn meal agar with Tween(R) 80 and API ID32C(R)) and sequence analysis of the ITS and D1/D2 region

RESUMEN

Antecedentes La prevalencia de infecciones oportunistas por levaduras ha aumentado en las últimas décadas como resultado de una población de pacientes inmunocomprometidos cada vez mayor. Objetivos: Evaluar la secuencia del gen del ARN ribosomal (ARNr) para identificar especies de levaduras médicamente importantes, investigar el rendimiento del espaciador transcrito interno del gen ARNr (ITS) y las regiones D1/D2 en la identificación de levaduras clínicamente relevantes, y comparar estos resultados con los de un método fenotípico estándar. Métodos: Ambas regiones del ARNr de 50 cepas de levaduras con 45 aislamientos clínicos y 5 cepas de referencia se amplificaron mediante PCR y posteriormente se secuenciaron. Las secuencias se compararon con los datos de referencia disponibles en la base de datos GenBank(R) del Centro Nacional de Información Biotecnológica mediante la herramienta BLASTn. Resultados: Mediante el método ID32C el 88% (44/50) de todas las cepas se identificaron con precisión y el 6% se identificaron erróneamente; dos aislamientos de Candida eremophila fueron identificados como Candida glabrata y Candida tropicalis, y un aislamiento de Saprochaete clavata fue identificado como Saprochaete capitata. Dos de los cuatro aislamientos identificados por métodos fenotípicos como Trichosporon asahii se catalogaron así al analizar la región ITS, pero las dos restantes no se distinguían de las especies estrechamente relacionadas. En base a la secuencia de la región D1/D2, estos cuatro aislamientos se identificaron, con un 100% de similitud, como T. asahii, Trichosporon japonicum y Trichosporon asteroides. El aislamiento identificado como Trichosporon inkin mediante ID32C no se pudo distinguir de Trichosporon ovoides al analizar las regiones ITS y D1/D2. Conclusiones: La identificación de levaduras de interés médico mediante la secuenciación de las regiones ITS y D1/D2 es una alternativa rápida y confiable a los métodos de identificación convencionales. Para un algoritmo de diagnóstico sugerimos un procedimiento de dos pasos que integre métodos convencionales (morfología microscópica en agar de harina de maíz con Tween(R) 80 y API ID32C(R)) y análisis de la secuencia de las regiones ITS y D1/D2