Determination of viability of Phytophthora capsici oospores with the tetrazolium bromide staining test versus a plasmolysis method

RESUMEN

Antecedentes. Las oosporas son los propágulos más persistentes de Phytophtora capsici. La viabilidad de las oosporas se puede determinar con métodos de tinción como el bromuro de tetrazolio (MTT). Objetivos. El MTT, y un método de plasmólisis, fueron comparados en su utilidad para determinar la viabilidad de las oosporas de P. capsici. Métodos. En cada procedimiento se compararon las reacciones de oosporas no tratadas (viables) y tratadas con calor letal (no viables) en diferentes cruces de aislados. Resultados. La plasmólisis proporcionó viabilidades menores que el MTT en casi todos los casos. La viabilidad estimada con MTT en oosporas autoclavadas osciló entre 26 y 35%, siendo nula la falsa positividad con plasmólisis. Los resultados determinados con ambas técnicas se correlacionaron significativamente (r=0,998, P=0,0001) en oosporas no tratadas (viables). La viabilidad de oosporas tratadas con calor en agua estéril a 52°C (0-2-4-20 horas) en uno de los cruces ensayado mediante plasmólisis fue 81-4-0,7-0% y mediante MTT fue 78-15,3-9-5,7% respectivamente, mostrando diferentes resultados en el otro cruce ensayado (57,7-1-1-0 y 50-7,3-7,7-9% respectivamente). Los resultados determinados con ambas técnicas en el conjunto de oosporas (autoclavadas, calentadas 52°C y no tratadas) mostraron una correlación positiva significativa (r=0,946, P<0,0001), aunque el MTT sobreestimó la viabilidad cuando los valores se aproximaban a 0. Conclusiones. El MTT resultó una prueba no objetiva, inestable y con alta proporción de falsos positivos al compararla con la plasmólisis en la que se obtuvieron resultados fiables. El MTT debería usarse junto a otras técnicas como la plasmólisis para determinar la viabilidad de las oosporas de P. capsici(AU)

ABSTRACT

Background. Oospores are the most persistent propagules of Phytophthora capsici. The viability of oospores is determined by staining methods such as the tetrazolium bromide (MTT) test. Objectives. The aim was to assess the MTT test and a plasmolysis method for their utility in determining viability of oospores of P. capsici. Methods. For either procedure the reactions of non-treated (viable) and lethally heat-treated (non-viable) oospores were assessed and compared with different matings of isolates. Results. The plasmolysis method provided lower estimates of oospore viability relative to MTT in almost all cases. Viability of autoclaved oospores determined by MTT ranged from 26 to 35%, while in the plasmolysis method, the false positive rate was null. Data of non-treated (viable) oospores determined by both techniques showed a significant positive correlation (r=0.998, P=0.0001). Viability assessments in the plasmolysis method of heated oospores in sterile water at 52°C (0-2-4-20hours) showed viability values of 81-4-0.7-0% while MTT values were 78-15.3-9-5.7% respectively. They both exhibited different values for the other tested mating (57.7-1-1-0% and 50-7.3-7.7-9% respectively). Data of autoclaved, heat-treated (52°C), and non-treated oospores determined by both techniques showed a significant positive correlation (r=0.946, P<0.0001). However, MTT always overestimated viability rates when values were near zero. Conclusions. MTT staining was non-objective, unstable and with a high rate of false positives. In contrast, reliable results were obtained using the plasmolysis method. MTT should be used in combination with other techniques such as the plasmolysis method for determining viability of P. capsici oospores(AU)