Desenvolvimento de vacinas de DNA contra o vírus da dengue baseadas na proteína do envelope viral / Development of DNA vaccines against dengue virus based on viral envelope protein

RESUMO

A dengue é uma doença causada pelo vírus da dengue (DENV1- 4). Apesar dos vários estudos, ainda não existe uma vacina comercialmente disponível. A proteína do envelope (E) de DENV apresenta-se como o maior componente protéico da superfície viral. Conseqüentemente, esta proteína é o principal alvo para a indução de uma resposta imune protetora, provavelmente baseada em anticorpos neutralizantes. No presente trabalho, nós avaliamos o potencial protetor de vacinas de DNA baseadas na proteína E de DENV2. para isto, foram construídos dois pasmídeos, pE1D2 e pE2D2, que contêm as seqüências que codificam o eCtodomínio da proteína E (domínios I, II e III) ou somente o seu domínio III, respectivamente, clonadas da montante à seqüência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA). Os dois plasmídeos mediaram à expressão e secreção das proteínas recombinantes in vitro em células eucarióticas, detectadas com anticorpos anti-DENV2 e avaliadas por ensaios de imunofluorescência ou marcação metabólica seguida de imunoprecipitação. Ambas as vacinas de DNA foram capazes de induzir respostas imunes com produção de anticorpos neutralizantes em camundongos Balb/c, com títulos mais elevados nos animais imunizados com o pE1D2. A vacina Pe1D2 também se mostrou mais protetora nos testes de desafio com uma dose letal de DENV2, induzindo 100 porcento de sobrevivência nos camundongos imunizados, enquanto que 45 porcento dos animais vacinados com o plasmídeo Pe2D2 morreram após a infecção. Além disso, 10 porcento e 65 porcentodos camundongos imunizados com pE1D2 e pE2D2, respectivamente, apresentaram morbidade frente ao desafio letal. As vacinas pE1D2 e pE2D2 também foram testadas combinadas com o vírus quimérico YF17D-D2, em um sistema de dose e reforço ou em imunizações simultâneas. O vírus quimérico YF17D menos D2 foi construído com a substituição dos genes prM e E do vírus vacinal da febre amarela 17DD pelos genes prM e E de DENV2. a vacina de DNA pE1D2 combinada com a quimera YF17D menos D2 induziu altos níveis de anticorpos neutralizantes nos animais vacinados com os diferentes esquemas de imunização. Além disso, esses animais apresentaram 100 porcento de sobrevivência frente ao desafio letal com DENV2, com ausência de qualquer sinal clinico da infecção. O efeito sinérgico da imunização combinada também foi evidenciado quando combinamos a vacina pE2D2 e YF17D menos D2, que gerou 100 porcento de sobrevivência nos animais desafiados. A resposta imune celular foi avaliada pela produção de IFN- por células TCD8 mais em ensaios de ELISPOT, evidenciando a ativação destas células nos animais imunizados com as pE1D2 independente da sua combinação com a quimera YF17D menos D2. Além disso, a análise do perfil fenotípico das células TCD4 a mais e TCD8 mais mostrou um percentual menor de linfócitos CD62L mais nos animais vacinados com o pE1D2 isolado ou combinado com o vírus quimérico, indicando que a vacina de DNA pode influenciar nos processos de ativação das células T. Posteriormente, foram construídas novas vacinas de DNA que codificam os ectodomínios da proteína E de DENV1, 3 e 4 (pE1D1, pE1D3 e pE1D4), cuja expressão foi confirmada in vitro, e que serão testadas futuramente em modelos animais.