Estudo do potencial regulador da crotoxina e suas subunidades isoladas do veneno de Crotalus durissus terrificus sobre a atividade funcional de células dendríticas / Modulatory potential of crotoxin and its subunits isolated from Crotalus durissus terrificus venom on dendritic cells

ABSTRACT

Pathogens as well as pathogenic molecules are able to activate or modulate the immune system. The Crotalus durissus terrificus rattlesnake venom, its main toxin, crotoxin (CTX) and the CA (crotapotin) or CB (phospholipase A2) subunits have suppressive effect on the immune system. Dendritic cells (DCs) are potent cells from innate immunity responsible by antigen presentation to T lymphocytes and, thus are directly involved in the generation of the adaptive immune response or tolerance. Therefore, we evaluated the modulatory effect of CTX as well as its subunits on functional activity of DCs in vitro. The CTX, CA and CB were purified, analyzed by SDS-PAGE and the endotoxin (LPS) content removed. The cytometric analysis of CD11c expression by cells showed that the protocol using GM- CSF/IL-4 was more efficient in generating DCs in vitro than GM-CSF. Furthermore, these immature CD11c+ cells expressed Toll like receptors 1, 2, 4 and C-type lectin receptors (DCSIGN and MR). DCs were incubated with CTX, CA, CB with or without LPS for 7 days and then analyzed for the expression of class II MHC (MHC-II), CD40, CD80 e CD86 molecules as well as the secretion of proinflammatory cytokines (IL-1β, IL-12, IL-6, TNF-α). CTX, CA or CB did not induce increased expression of costimulatory and MHC-II molecules by DCs, whereas LPS induced high expression of these molecules on DCs. Furthermore, CTX and CB inhibited the expression of CD40, CD80, CD86 and MHC-II molecules by DCs incubated with LPS. Both CTX and CB inhibited the secretion of proinflammatory cytokines by DC stimulated with LPS. However, CA was not able to inhibit the DC maturation induced by LPS. It was also verified that formyl peptide receptor is involved in this effect of CTX and CB on DC maturation induced by LPS. Analysis of IL-10 secretion and gene expression of TGFβ and IL-10 showed that CTX and, at lower intensity the CB, induced high amounts of these anti-inflammatory cytokines by DCs incubated only with the toxins or with LPS. In addition, it was verified increased secretion of prostaglandin E2 and lipoxin A4 by DCs incubated with CTX and CB and, at lower intensity with CA, in the presence or not of LPS. Proliferation assay of CD3+ lymphocytes co-cultured with DCs previoulsy incubated with CTX or CB with or without LPS showed that CTX and CB inhibited the cellular proliferation induced by LPS. These results demonstrate that CTX and CB subunit, but not CA, exert modulatory effect on functional activity of DCs and suggest the involviment of anti-inflammatory mediators in this process.

RESUMO

Agentes patogênicos, assim como moléculas com potencial patogênico são capazes de ativar/modular o sistema imune. O veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus, crotoxina (CTX-principal toxina) e suas subunidades CA (crotapotina) ou CB (fosfolipase A2) apresentam efeito supressor sobre o sistema imune. Células dendríticas (DCs) são potentes células da imunidade inata responsáveis pela apresentação dos antígenos para os linfócitos T e, portanto estão envolvidas diretamente na geração da resposta imune adaptativa ou tolerância imunológica. Portanto, no presente estudo, foi investigado o efeito modulador da CTX, bem como da CA e CB sobre a atividade funcional das DCs in vitro. CTX, CA e CB foram purificadas, analisadas por SDS-PAGE e o conteúdo de endotoxina (LPS) eliminado. DCs imaturas (iDCs) foram diferenciadas a partir da medula óssea de camundongos BALB/c com GM-CSF ou GM-CSF/IL-4 por 7 dias. A análise por citometria de fluxo da expressão de CD11c revelou que o protocolo de utilização do GM-CSF/IL-4 foi mais eficiente em gerar DCs in vitro. Além disso, estas células imaturas (CD11c+ ) expressam receptores do tipo Toll 1, 2, 4 e de lectina tipo C (DC-SIGN e MR). DCs imaturas foram incubadas com CTX, CA ou CB na presença ou não de LPS e analisadas quanto à expressão das moléculas de MHC de classe II (MHC-II), CD40, CD80 e CD86, bem como a secreção de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-12, IL6, TNF-α). A CTX, CA e CB não induziram aumento da expressão das moléculas MHC-II e coestimuladoras nas DCs in vitro, enquanto que o LPS induziu alta expressão dessas moléculas nas DCs. Além disso, CTX e CB inibiram a expressão de CD40, CD80, CD86 e MHC-II em DCs incubadas com LPS, sendo esse efeito mais acentuado com a CTX. Tanto a CTX como CB inibiram a secreção das citocinas pró-inflamatórias pelas DCs estimuladas com LPS. Por outro lado, a subunidade CA não foi capaz de modular a maturação de DCs induzida pelo LPS. Pôde ser observado ainda, que receptor formil peptídeo está envolvido nesse efeito da CTX e CB sobre a maturação das DCs induzida pelo LPS. A análise da secreção IL-10 e expressão gênica de TGF-β e IL-10 pelas DCs incubadas com CTX, CA, CB na presença ou não de LPS mostraram que a CTX e, em menor intensidade, a CB induzem aumento dessas citocinas pelas DCs incubadas somente com as toxinas ou juntamente com LPS. Além disso, foi observada maior produção de prostaglandina E2 e lipoxina A4 pelas DCs incubadas com CTX ou CB, e em menor intensidade com CA, na presença ou não de LPS. O ensaio de proliferação de linfócitos CD3+ cocultivados com DCs previamente incubadas com CTX ou CB na presença ou não de LPS mostrou que a CTX e CB em associação com LPS inibiram a proliferação celular quando comparada à induzida somente pelo LPS. Estes resultados demonstraram que a CTX e CB, mas não CA, exercem efeito modulador sobre a atividade funcional das DCs e sugerem a participação dos mediadores antiinflamatórios nesse processo.