Quantification assay for the major allergen of Cupressus sempervirens pollen, Cup s 1, by sandwich ELISA

ABSTRACT

Background: The Cupressaceae are an important cause of pollinosis, particularly in Mediterranean countries. Cypress pollen allergenic extracts are difficult to produce since they have a low protein and a high carbohydrate content and consequently accurate standardization of these extracts is essential for diagnosis and immunotherapy. Method: Natural Cup s 1 was purified by a combination of hydrophobic interaction, gel filtration and ion exchange chromatographies and its enzymatic activity was analyzed. The allergen was used as reference material in the ELISA standard curve. The assay was based on a specific monoclonal antibody (3D2) immobilized on ELISA plates and used to capture Cup s 1. Bound proteins were detected by a combination of biotinylated specific antiserum and peroxidase-conjugated streptavidin. Results: Purified Cup s 1 is a functional pectate lyase enzyme with a specific activity of 750 U/mg protein. The developed ELISA measured Cup s 1 concentrations ranging from 31.25 to 250 ng/ml in the lineal portion of the standard curve. The intra-assay and inter-assay variation coefficients in the working range were less than 8.1 % and 16 %, respectively. The assay was highly sensitive, with a detection limit of 3.8 ng/ml. The dose-response curves obtained with C. sempervirens pollen extracts and extracts belonging to other species from the Cupressaceae family showed a good parallelism compared with those obtained using the purified allergen, indicating that the same protein was measured. Conclusions: The assay described is sensitive, specific and reproducible for the quantification of Cup s 1 in C. sempervirens pollen extracts for clinical use. This ELISA could also be useful for other Cupressaceae-related pollen extracts (AU)

RESUMEN

Antecedentes: Las cupresáceas son una importante causa de polinosis, particularmente en los países Mediterráneos. Los extractos alergénicos de polen de ciprés son difíciles de producir ya que tienen bajo contenido de proteínas y alto de carbohidratos, por lo que es esencial una precisa estandarización de estos extractos para su uso en diagnóstico e inmunoterapia. Método: El alergeno natural Cup s 1 fue purificado mediante interacción hidrofóbica, tamizado molecular, e intercambio iónico, y se analizó su actividad enzimática. Este alergeno fue utilizado como referencia en la realización de la curva de calibrado del ensayo. El ensayo se basó en un anticuerpo monoclonal (3D2) inmovilizado en la plaza y usado para capturar a Cup s 1. Posteriormente un antisuero es- pecífico contra Cup s 1 marcado con biotina unido a estreptavidina conjugada con la enzima peroxidasa sirvieron como detectores del alergeno unido. Resultados: Se determinó que Cup s 1 es una enzima funcional con actividad pectato liasa y una actividad específica de 750 U/mg. La parte lineal de la curva estándar del ELISA fue considerada la zona óptima de ensayo y se situaba entre 250 y 31,25 ng/ml, siendo en este intervalo los coeficientes de variación intraensayo e interensayo menores del 8,1 por ciento y del 16 por ciento respectivamente. Además de reproducible, el ensayo resultó sensible con un límite de detección de 3,8 ng/ml. Las curvas obtenidas con los extractos de C. sempervirens y otros extractos de polen de géneros de la familia Cupressaceae fueron paralelas a la del alergeno purificado indicando que se estaba midiendo la misma proteína. Conclusiones: Se describe un ensayo que resulta específico y de gran sensibilidad para la cuantificación de Cup s 1 en extractos de polen de C. sempervirens de uso clínico, y que puede ser aplicable a otros géneros de la familia Cupressaceae (AU)