A N-glicosilação do EGFR afeta a sinalização intracelular e a estabilidade das Junções Tight em células de câncer colorretal / [ EGFR N-glycosylation affects intracellular signaling and stability of Tight Junctions in Colorectal Cancer Cells]

RESUMO

Introdução: O câncer colorretal (CCR) constitui um importante problema de saúde pública no Brasil e no mundo. Durante a progressão de tumores epiteliais, como o CCR, é frequentemente observada uma desestabilização do complexo juncional apical, composto pelas junções tight (JT) e junções aderentes (JA). O aumento dos níveis de expressão das claudinas, principais proteínas transmembranas constituintes das JT, induz a perda da sua função de barreira e aumenta o potencial maligno das células do CCR. Embora cada vez mais estudos estejam focados em compreender melhor os aspectos moleculares que regulam a estabilidade das TJ, o papel desempenhado por N-glicanos neste processo continua sendo pouco explorado. Objetivo: Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar o papel dos N-glicanos na regulação da estabilidade das JT em CCR. Materiais e Métodos: Utilizando a linhagem celular HCT-116 (carcinoma colorretal humano), foi avaliado o efeito do tratamento com dois inibidores de biossíntese de N-glicanos, swainsonina (SW) e tunicamicina (Tun), sobre a estabilidade das JT mediante citometria de fluxo, Western blot, microscopia eletrônica de transmissão, co-imunoprecipitação e imunofluorescência. A expressão de ácido siálico na superfície celular também foi inibida utilizando análogo fluorinado de ácido siálico (Sia-F). Além disso, foram avaliados o grau de N-glicosilação do Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR) e os níveis de expressão de claudina-3 (cld-3) em tecidos de pacientes com CCR (n = 21) por imunohistoquímica e Western blot (Protocolo-CEP nº 84/04). Para este estudo foram consultadas bases de dados internacionais (NCBI e TCGA) a fim de identificar os sítios de N-glicosilação (Asn-XSer/Thr) do EGFR e relatos de mutações nestes sítios em CCR. Utilizando um algoritmo classificador de subtipos de CCR foi avaliada também a expressão de glicogenes e de cld-3 em quatro subtipos moleculares de CCR. Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação Resultados: Primeiramente, foi avaliado o efeito de SW e Tun na expressão proteica de vários constituintes das TJ. Foi observado que apenas o tratamento com Tun diminuiu os níveis de expressão de cld-3. A Tun também promoveu, concomitantemente, diminuição dos níveis de fosforilação de proteínas na faixa de peso molecular da cld-3 (22kDa) e reorganização da sua localização celular do citoplasma à membrana. Os resultados mostraram que, após o tratamento com Tun, as células HCT-116 desenvolveram contatos celulares mais estabelecidos. Além disso, a deglicosilação do EGFR promoveu redução dos seus níveis de expressão na membrana celular e também diminuiu tanto os seus níveis de ativação quanto a fosforilação das proteínas downstream ERK e AKT. Foi observado que o tratamento com Sia-F diminuiu tanto a ativação de EGFR quanto os níveis de expressão de cld-3. Os resultados mostraram também que tumores de pacientes com CCR, que expressavam maiores níveis proteicos de cld-3 do que os respectivos tecidos normais adjacentes, exibiram também um maior grau de N-glicosilação do EGFR. Finalmente, não foram encontrados relatos de mutações em sítios de N-glicosilação do EGFR em CCR, porém, foram encontradas diferenças na expressão de glicogenes e de cld-3 entre os quatro subtipos moleculares de CCR. Conclusão: Conjuntamente, os resultados demonstram que a N-glicosilação do EGFR desempenha um papel na regulação da cld-3, contribuindo para uma melhor compreensão da biologia do CCR. Estes achados também sugerem um potencial significado clínico de alterações no padrão de N-glicosilação do EGFR.