Aspectos imunológicos e genéticos da expressão da integrina A4B7 na história natural e na intervenção terapêutica da infecção por lentivírus no homem e em modelos animais / [Immunological and genetic aspects of integrin expression A4B7 in the natural history and therapeutic intervention of infection by lentivirus in humans and animal models]

RESUMO

Integrinas são proteínas envolvidas na migração e adesão celular. Estudos recentes mostraram que a integrina α4ß7 interage com a proteína gp120 do HIV-1, auxiliando a entrada do vírus na célula hospedeira através de sinapses virológicas. Já foi demonstrada uma maior prevalência do genótipo C-C do SNP rs1449263, localizado na região promotora do gene itga4 (que codifica a subunidade α4 da integrina), em pacientes com esclerose múltipla. Estes pacientes apresentam uma alta expressão de integrina, sugerindo o envolvimento deste SNP na superexpressão da mesma. A interação de α4ß7 com seu ligante natural, MAdCAM, pode ser uma importante fonte de estímulo, capaz de gerar sinais intracelulares culminando com a ativação de linfócitos T. Diversos estudos tem avaliado o papel da integrina α4ß7 na transmissão do HIV em mucosas, bem como a utilização de anticorpos bloqueadores desta proteína como novas terapias para prevenção e tratamento da infecção. Neste sentido, a utilização de primatas não-humanos como modelos de estudo da infecção por SIV/HIV é de suma importância e utilidade. Neste estudo, avaliamos a prevalência dos diferentes genótipos do SNP rs1449263 e o perfil de expressão da integrina α4 em indivíduos de três coortes diferentes que compreendem adultos HIV+ e HIV- , e em crianças HIV+ ou expostas ao vírus e não-infectadas. A partir de PBMCs foram isolados DNA genômico e RNA para a avaliação dos genótipos encontrados e expressão relativa dos genes itga4, itgb7 e itgae. Esta última pode também se ligar a subunidade ß7 e competir com α4. Não foram observadas associações entre os genótipos e alelos do SNP estudado e a aquisição do HIV ou progressão para a Aids. Em relação à expressão de itga4, indivíduos portadores do alelo C apresentaram maior expressão do que os não-portadores. A expressão de itgb7 foi compatível com a de itga4 e o mesmo resultado foi observado por citometria de fluxo. Não foi observada expressão de itgae em níveis compatíveis aos de itgb7. Aplicando técnicas de cultura celular e citometria de fluxo, mostramos que MAdCAM pode atuar como molécula co-estimulatória de células T CD4+ naïves. Apesar deste estímulo não induzir proliferação celular, linfócitos cultivados na presença de MAdCAM são capazes de suportar a replicação do HIV in vitro. Este efeito mostrou-se mais intenso quando o estímulo foi realizado em presença de ácido retinóico (que induz a expressão de α4ß7) ou anti-CD28, induzindo até mesmo a proliferação dos linfócitos naïves. Através de um estudo com primatas não-humanos infectados com SIV e tratados com antirretrovirais em combinação ou não com anti-α4ß7, pretendemos utilizar o sequenciamento de nova geração para avaliar a dinâmica das populações virais ao longo da infecção mediante os diferentes tratamentos administrados. Nesta tese, validamos os protocolos necessários para a execução deste projeto, mostrando que protocolos desenvolvidos para o sequenciamento de HIV podem ser adaptados e utilizados para o estudo de SIV. Os resultados desta tese destacam a importância da integrina α4ß7 na infecção por HIV sob diferentes aspectos como impacto clínico, estabelecimento de infecção em mucosas e possível alvo terapêutico.

ABSTRACT

Integrins are transmembrane glycoproteins found in many vertebrate cell types. Recent studies show that HIV gp120 can bind the α4ß7 integrin, providing a favorable environment for virus transmission between cells. α4ß7 is a homing molecule to the gut-associated lymphocyte tissue (GALT). This protein has an important role during the initial course of HIV infection, since intense viral replication and lymphocyte depletion is observed in the GALT during this phase. A higher prevalence of the C-C genotype in the SNP rs1449263, located in the promoter region of the itga4 gene (that encodes α4 integrin), has been shown in multiple sclerosis patients, possibly related to a higher expression of this gene. The interaction between α4ß7 and its natural ligand MAdCAM can lead to cell activation, promoting proliferation of T lymphocytes. Several studies highlight the role of α4ß7 in the mucosal transmission of HIV as well as its possible use as a target for HIV prevention and antiviral therapy. Studies with non-human primates are useful in this field, as these animals have similarities with humans and can be infected with SIV. In the present study, we assessed the prevalence of different SNP rs1449263 genotypes in three different cohorts harboring HIV+ and HIVadults, as well as HIV+ or exposed-uninfected children. SNP genotyping and gene expression analysis were carried out from DNA and RNA isolated from PBMCs. No association between SNP genotype and HIV acquisition or progression to AIDS was observed in the cohorts. With respect to itga4, itgb7 (ß7) and itgae (αE) gene expression, a higher level of itga4 mRNA was observed in allele C carriers, compared to noncarriers. The itgb7 expression was compatible to itga4 levels and this result was confirmed by cell surface expression through flow cytometry. In some cases, the itgb7 levels were higher than itga4, raising the question whether ß7 could be pairing with its other partner, αE, but itgae levels were too low, and not compatible with itgb7 levels. Using T cell culture with different ligands and flow cytometry, we showed that MAdCAM can act as a co-stimulatory molecule on CD4+ naïve T cells. Despite the lack of cell proliferation under these conditions, naïve T lymphocytes cultured in presence of MAdCAM supported HIV replication in vitro. This effect was even more pronounced when retinoic acid (which upregulates α4ß7 expression) or anti-CD8 was added to the culture, and in this case cell proliferation was observed. In a study using non-human primates infected with SIV and treated to antiretroviral therapy (ART) in combination or not with anti-α4ß7 monoclonal antibody, some of the anti-α4ß7 treated animals were able to control viral replication when ART was discontinued. With this in mind, we aim to assess the viral population dynamics along the infection. This analysis will be done by next-generation sequencing (NGS). In this Thesis, we describe a protocol to be used with SIV samples, that was adapted and tested from two different protocols designed to HIV NGS sequencing. The results of this Thesis highlight the importance of integrin α4ß7 in HIV infection in different aspects such as clinical impact, establishment of infection in mucosal tissues and its use as a possible therapeutic target.