Reposicionamento de fármacos para cryptococose: avaliação experimental do cloridrato de duloxetina em Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii / Repositioning of drugs for cryptococcosis: experimental evaluation of duloxetine hydrochloride in Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gatti

RESUMO

Infecções fúngicas como as causadas por Cryptococcus spp. são de alta mortalidade e morbidade. O reposicionamento de fármaco, ou seja, a utilização de compostos para finalidade diferente da qual esse foi desenvolvido, pode ser uma alternativa para identificar fármacos mais eficazes. Assim, este estudo tem como propósito avaliar a atividade antifúngica, in vitro e in vivo, do fármaco cloridrato de duloxetina (CD), antidepressivo pertencente a classe dos Inibidores Seletivos da Recaptação da Serotonina e Norepinefrina frente a cepas padrões e clínicas de Cryptococcus neoformans e C. gattii. Foi utilizada a técnica de microdiluição de acordo com o European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) para determinar a Concentração Inibitória Mínima (MIC), e a técnica do "tabuleiro de xadrez" para avaliar o efeito sinérgico de anfotericina B (AmB) em associação com CD. Além disso, foi avaliado o efeito de CD na quantidade do ergosterol. O efeito do CD também foi avaliado em biofilmes de C. neoformans e C. gattii, analisando a biomassa por cristal violeta, a viabilidade celular por XTT e morfologia através das imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). In vivo, a eficácia de CD foi avaliada por curvas de sobrevivência no modelo invertebrado Galleria mellonella. CD foi ativo frente a todas as cepas clínicas e padrões de C. neoformans e C. gattii, apresentando valores de CIM e CFM na faixa de 15,62 ­ 62,5 µg/mL. A combinação de CD com AmB apresentou uma combinação sinérgica, reduzindo o valor da CIM em 4 vezes tanto para CD quanto para AmB. CD não produziu redução na quantidade de ergosterol presente na membrana de C. gattii ATCC e C. neoformans ATCC. Em biofilmes, foi observada a redução da biomassa do biofilme em até 82,16% e redução de 99,6% na viabilidade celular de C. gattii. Em biofilmes de C. neoformans a redução foi de 81,13% e 99,5% respectivamente para a análise de biomassa e viabilidade. As imagens de MEV corroboraram com os achados dos ensaios realizados para análise do efeito de CD em biofilmes. Em G. mellonella aumentou a sobrevivência da larva quando utilizado na concentração de 3,125 mg/larva. Assim, os ensaios validaram a hipótese de que o cloridrato de duloxetina tem ação antifúngica e antibiofilme in vitro frente a cepas clínicas e cepas padrões de C. neoformans e C. gattii. (AU)

ABSTRACT

Fungal infections such as those caused by Cryptococcus spp. are of high mortality and morbidity. Drug repositioning, that is, the use of compounds for a purpose different from the one for which it was developed, can be an alternative to identify more effective drugs. Thus, this study aims to evaluate the antifungal activity, in vitro and in vivo, of the drug duloxetine hydrochloride (CD), an antidepressant belonging to the class of Selective Serotonin and Norepinephrine Reuptake Inhibitors against standard and clinical strains of Cryptococcus neoformans and C. gattii. The microdilution technique according to the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) was used to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), and the "chessboard" technique was used to evaluate the synergistic effect of amphotericin B (AmB) on association with CD. In addition, the effect of CD on the amount of ergosterol was evaluated. The effect of CD was also evaluated in C. neoformans and C. gattii biofilms, analyzing the biomass by crystal violet, cell viability by XTT and morphology through Scanning Electron Microscopy (SEM) images. In vivo, the effectiveness of CD was evaluated by survival curves in the Galleria mellonella invertebrate model. CD was active against all clinical strains and patterns of C. neoformans and C. gattii, with MIC and CFM values in the range of 15.62 ­ 62.5 µg/mL. The combination of CD with AmB showed a synergistic combination, reducing the MIC value by 4 times for both CD and AmB. CD did not produce a reduction in the amount of ergosterol present in the membrane of C. gattii ATCC and C. neoformans ATCC. In biofilms, a reduction in biofilm biomass of up to 82.16% and a 99.6% reduction in cell viability of C. gattii were observed. In C. neoformans biofilms the reduction was 81.13% and 99.5% respectively for biomass and viability analysis. The SEM images corroborated the findings of the tests carried out to analyze the effect of CD on biofilms. In G. mellonella, larval survival increased when used at a concentration of 3.125 mg/larvae. Thus, the tests validated the hypothesis that duloxetine hydrochloride has antifungal and antibiofilm action in vitro against clinical strains and standard strains of C. neoformans and C. gattii.(AU)