Fibrina rica em plaquetas injetável (I-PRF): caracterização celular, morfológica e proteica / Injectable platelet-rich fibrin (I-PRF): cellular, morphological and protein characterization

RESUMO

Estudos experimentais demonstram o efeito da fibrina rica em plaquetas (PRF) nas técnicas de regeneração tecidual otimizando o processo de reparo; podendo ser utilizada na forma líquida (i-PRF). O objetivo dessa pesquisa foi determinar a composição celular do i-PRF, caracterizar sua morfologia a nível microscópico, investigar a expressão de proteínas envolvidas no processo de reparo e avaliar sua interação com um material biocerâmico a partir de um modelo in vitro. Materiais e métodos: Foram colhidas amostras sanguíneas de 15 voluntários humanos para comparação dos constituintes celulares entre o i-PRF e o sangue periférico. Amostras de i-PRF e de coágulos sanguíneos foram cultivadas in vitro durante 10 dias. O sobrenadante das amostras foi colhido nos intervalos 1h, 8h, 24h, 3 dias e 10 dias para quantificação dos fatores de crescimento PDGF-AB e VEGF por ELISA. Amostras foram tratadas histologicamente para caracterização morfológica e submetidas à marcação imuno-histoquímica para as proteínas IL-10, OC e TGF-ß. Investigou-se a expressão gênica do fator de transcrição Colágeno tipo 1. Foram preparadas amostras do i-PRF misturadas com cerâmica bioativa granulada (HA/ß-TCP) para avaliação da interação entre esses compostos através MEV. Resultados: Observou-se maior concentração de leucócitos (8.124 ± 1.419) e plaquetas (3.96x105 ± 0.72) no i-PRF em comparação ao sangue periférico (p <0.001), com uma maior proporção de linfócitos (60%) no i-PRF. Maiores níveis de VEGF foram liberados a partir do coágulo sanguíneo (1933 ± 704) em relação ao i-PRF (852 ± 376; p <0.001). Não foram observadas diferenças entre os níveis de PDGF-AB. Ensaio imuno-histoquímico demonstrou imunomarcação para TGF-ß, IL-10 e Osteocalcina no grupo i-PRF. Análises por RT-PCR demonstraram aumento da expressão de Colágeno tipo 1 no grupo do i-PRF. Microscopicamente observou-se a formação de grandes aglomerados de plaquetas e fibrina e uma rede de fibrina em distribuição tridimensional espacial com a presença de linfócitos distribuídos de forma homogênea. As imagens por MEV apresentaram boa integração entre os grânulos de cerâmica e a malha de fibrina formada pelo i-PRF. Conclusões: Análises morfológicas revelaram que o processo de produção do i-PRF resulta em uma rede tridimensional de fibrina a qual incorpora plaquetas, leucócitos, colágeno tipo I, osteocalcina e fatores de crescimento. Assim, o i-PRF torna-se uma boa abordagem como um material líquido para ser associado a outros biomateriais (AU).

ABSTRACT

One of the great challenges of clinical research is the development of new biomaterials that aid in tissue regeneration and accelerate the healing process. Experimental studies demonstrate the effect of platelet rich fibrin (PRF) on tissue regeneration techniques thereby optimizing the repair process, and can also be used in liquid form (i-PRF). The objective of this research was to determine the cellular composition of i-PRF, to characterize its morphology at a microscopic level, to investigate the expression of proteins involved in the repair process and to evaluate its interaction with a bioceramic material from an in vitro model. Materials and methods: Blood samples were collected from 15 human volunteers to compare the cellular constituents between i-PRF and peripheral blood. I-PRF and blood clot samples were cultured in vitro for 10 days. The supernatant of the samples was collected at intervals of 1h, 8h, 24h, 3 days and 10 days for quantification of PDGF-AB and VEGF growth factors by ELISA. Samples were histologically treated for morphological characterization and submitted to the immunohistochemical methodology for the labeling of IL-10, OC and TGF-ß proteins. The gene expression of collagen transcription factor type 1 was investigated. I-PRF samples mixed with granular bioactive ceramics (HA/ß-TCP) were prepared to evaluate the interaction between these compounds through SEM. Results: A higher concentration of leukocytes (8.124 ± 1.419) and platelets (3.96x105 ± 0.72) in i-PRF compared to peripheral blood (p <0.001) was observed, with a higher proportion of lymphocytes (60%) in i-PRF. Higher levels of VEGF were released from the blood clot (1933 ± 704) compared to i-PRF (852 ± 376; p <0.001); no differences were observed between PDGF-AB levels. Immunohistochemical assay demonstrated expression for TGF-ß, IL-10 and Osteocalcin in the i-PRF group. RT-PCR analysis showed increased expression of collagen type 1 in the i-PRF group. The formation of large platelets, fibrin clusters and a fibrin network in a three-dimensional spatial and homogeneous distribution were observed microscopically. SEM images showed good integration between the ceramic granules and the fibrin mesh formed by i-PRF. Conclusions: Morphological analyses revealed that the slow polymerization of i-PRF results in a three-dimensional fibrin network embedding platelets, leukocytes, type I collagen, osteocalcin, and growth factors. Thus, i-PRF becomes a good approach as an injectable material to be associated with other biomaterials (AU).