Novos parâmetros para o clareamento dental: avaliação da eficácia, citotoxicidade e efeitos moleculares / New parameters for tooth bleaching: evaluation of bleaching effectiveness, cytotoxicity and molecular effects

RESUMO

Nesta pesquisa, foram analisadas a eficácia clareadora, citotoxicidade e características fenotípicas de células pulpares expostas a protocolos de clareamento de consultório experimentais. No primeiro estudo, discos de esmalte/dentina foram submetidos a 6 sessões clareadoras, caracterizadas por 1 ou 3 aplicações de peróxido de hidrogênio (H2O2) a 35% ou 17,5%, por 5 ou 15 min, ou de peróxido de carbamida (PC) a 37%, por 10 ou 20 min. A alteração de cor (ΔE) e quantificação da difusão de H2O2 (violeta leuco-cristal/peroxidase) foram avaliadas. Todos os protocolos testados promoveram alteração significativa de cor associados a redução na difusão de H2O2; no entanto, o gel com PC apresentou os piores resultados (Traço de Pilai; Bonferroni/p<0,05). Apenas os protocolos 35% H2O2/ 1x 15 e 3x 5 min, 17,5% H2O2/ 3x 15 min e 37% PC/ 3x 20 min apresentaram valores de E similares ao protocolo tradicional (35%/ 3x 15 min) em até 6 sessões de clareamento (ANOVA; SNK e Tamhane/p>0.05). No segundo estudo, foi avaliada a citotoxicidade trans-amelodentinária causada pela aplicação de protocolos experimentais usando 35% H2O2/ 1x 15 e 1x 5 min e 17,5% H2O2/ 3x 15, 1x 15 e 1x 5 min. O protocolo 35% H2O2/ 3x 15 min foi empregado como controle positivo. Os discos de esmalte/dentina foram adaptados em dispositivos trans-well, os quais foram posicionados sobre células odontoblastóides (MDPC-23) e cultura primária de células pulpares humanas (HDPCs) previamente semeadas. A viabilidade (MTT) e morfologia celular (MEV) foram avaliadas imediatamente e 72 h pós-clareamento, bem como o estresse oxidativo e lesão à membrana celular (microscopia de fluorescência). Todos os protocolos experimentais avaliados reduziram significativamente o dano celular quando comparados ao controle positivo (Kruskal-Wallis; MannWhitney/p<0,05). Esta redução foi tempo/concentração dependente. As células expostas aos protocolos com o gel contendo 17,5% de H2O2 apresentaram capacidade de recuperação em torno de 50% três dias pós-clareamento. No terceiro estudo, células pulpares (MDPC-23 e HDPCs) em cultura foram submetidas aos protocolos experimentais, utilizando-se para isto um gel com 17,5% de H2O2, o qual foi aplicado por 3x 15; 1x 15; e 1x 5 min sobre o esmalte. Então, foi avaliada a expressão de marcadores de diferenciação odontoblástica (expressão gênica de DMP-1, DSPP e ALP, deposição de nódulos de mineralização e atividade de ALP), em períodos de 7, 14 e 21 dias pós-clareamento, bem como a expressão gênica de mediadores inflamatórios (IL-1ß; TNF-α, IL-6 e COX-2) imediatamente após o procedimento clareador. Foi observado aumento significante na expressão gênica dos mediadores inflamatórios nas células clareadas proporcional ao tempo de tratamento (Kruskal-Wallis; Mann-Whitney/p<0,05). Houve, ainda, redução tempo/dependente na expressão dos marcadores de diferenciação em relação ao controle negativo (sem tratamento); no entanto, as células foram capazes de se recuperar da agressão em períodos de até 21 dias pós-clareamento, com exceção para a deposição nódulos de mineralização pelas HDPCs no grupo clareado por 45 min (Kruskal-Wallis; Mann-Whitney/p<0,05). Pode-se concluir que a redução na concentração e/ou freqüência de aplicação de géis clareadores à base de H2O2 sobre o esmalte promove clareamento efetivo, associado a reduzida difusão deste radical livre pela estrutura dental, o que minimiza seu efeito tóxico sobre as células pulpares. No entanto, o gel com 17,5% de H2O2 aplicado por curtos períodos sobre o esmalte apresentou-se como a alternativa clareadora mais interessante, visto que as células apresentaram maior capacidade de recuperação, bem como mantiveram seu potencial para diferenciação odontoblástica e deposição de matriz mineralizada

ABSTRACT

In this study, the bleaching effectiveness, cytotoxicity and phenotypic characteristic of dental pulp cells exposed to experimental in-office bleaching protocols were analyzed. In the first study, enamel/dentin discs were subjected to 6 bleaching sessions, composed by 1 or 3 applications of a 35%- or 17.5%-H2O2 (hydrogen peroxide) gel, during 5 or 15 minutes, or by a 37%-CP (carbamide peroxide) gel, applied for 10 or 20 minutes. Color change (ΔE) and H2O2 diffusion (leucocrystal violet/ peroxidase) were analyzed. All the tested protocols promoted significant color alteration and reduction of H2O2 diffusion; however, the CP gel presented the worst results (Pillai's trace/ Bonferroni test; p<0.05). Only the protocols 35%-H2O2/ 1x 15, 35%-H2O2/ 3x 5 min, 17.5%-H2O2/ 3x 15 min and 37%-CP 3x 20 min presented similar E values than traditional protocol (35%-H2O2/ 3x 15 min) up to 6 sessions (ANOVA; SNK and Tamhane tests/p>0.05). In the second study, the trans-enamel and trans-dentinal cytotoxicity on dental pulp cells of selected experimental bleaching protocols (35%- H2O2/ 1x 15 and 1x 5 min; 17.5%-H2O2/ 3x 15, 1x 15 and 1x 5 min) were tested. The protocol 35%- H2O2/ 3x 15 min was considered as the positive control group. The enamel/dentin discs were adapted to trans-wells devices, which were positioned over odontoblast-like cells (MDPC-23) and primary culture of human dental pulp cells (HDPCs) previously seeded on culture plates. The cell viability (MTT) and morphology (SEM) were evaluated immediately and 72 h post-bleaching, as well as oxidative stress and cell membrane damage (fluorescence microscopy). The experimental protocols promoted significant minimization of cell damage, for all evaluated parameters, when compared to positive control, in a time/concentration fashion (Kruskal-Wallis; Mann-Whitney/ p<0.05). Cells exposed to protocols with the 17.5%-H2O2 gel presented cell recovery capability in around 50% three days after bleaching. In the third study, the cells were exposed to the experimental protocols with the 17.5%-H2O2 gel (3x 15, 1x 15 and 1x 5 min), and the expression of odontoblastic differentiation markers (gene expression of DMP-1, DSPP and ALP, mineralized nodule deposition and ALP activity) was analyzed 7, 14 and 21 days after bleaching. Gene expression of inflammatory mediators (IL-1ß; TNF-α, IL-6 e COX-2) was assessed immediately after bleaching. It was observed upregulation of inflammatory mediators gene expression on bleached cells, which was proportional to treatment time. Reduction on differentiation markers expression related to negative control (no treatment) in a time/dependent fashion was also observed on bleached cells; however, the cells were able to recovery up to 21 days, excepting for mineralized nodule deposition by HDPCs on the 45-minute group (Kruskal-Wallis; Mann-Whitney/p<0.05). It was concluded that the reduction on concentration and/or frequency of application of H2O2 based gels promotes effective bleaching, associated to reduction on H2O2 diffusion through dental structure, and consequently minimization of toxic effects over two cell lineages from pulp tissue. However, the 17.5%-H2O2 gel applied for short periods appeared to be an interesting alternative, as the cells presented capability to recovery its viability, as well as kept its potential for odontoblastic differentiation and deposition of mineralized matrix