Efeito do extrato insaponificável de abacate e soja na doença periodontal induzida, na osseointegração de implantes e no reparo de defeitos críticos de calvaria de ratos / Effect of the avocado/soybean unsaponifiables on the induced periodontitis, on the osseointegration, and on the critical sized calvaria bone defect repair in rats

RESUMO

Esse estudo teve como objetivo avaliar, em ratos, a influência da utilização do extrato de óleo insaponificável de abacate e soja (ASU) no reparo da periodontite induzida por ligaduras, na osseointegração de implantes e na integração de biomateriais osteocondutores. Para isso foram avaliadas as hipóteses de que o ASU poderia 1)Aumentar o reparo da periodontite induzida; 2)Favorecer o reparo associado ao tratamento da periodontite induzida; 3)Acelerar a osseointegração; 4)Influenciar na integração de enxertos osteocondutores. Para a avaliação da primeira hipótese foram utilizados 84 ratos que foram submetidos a indução da periodontite por meio de ligaduras e que foram randomicamente divididos em 4 grupos CTR Administração do soro fisiológico(SS) no mesmo dia da indução da periodontite; ASU/-7 Administração de ASU iniciada 7 dias antes da indução de periodontite(0.6 mg/kg); ASU/0 Administração de ASU iniciada no dia da indução da periodontite; ASU/+7 Administração do ASU iniciada no dia da remoção da ligadura. As ligaduras, que foram inseridas bilateralmente nos segundos molares superiores, foram removidas após 7 dias e os medicamentos foram administrados diariamente por gavagem até o sacrifício dos animais (7, 15 e 30 dias). Foram realizadas análise microtomográfica (%volume ósseo), histomorfométricas (% osso na região da furca, distancias da junção cemento-esmalte(JCE) ao topo da crista óssea(CO) e a porção apical do epitélio juncional (aJE), imunohistoquímica (TRAP, RANKL e Fosfatase Alcalina) e de qPCR (IL1ß, IL6,TNFα, RANKL e Fosfatase Alcalina). Para avaliação da segunda hipótese foram utilizados 84 ratos que foram submetidos a indução da periodontite por meio de ligaduras e que foram randomicamente divididos em 4 grupos SRP-Administração de SS no dia do tratamento; SRP/ASU-7 Administração do ASU iniciada 7 dias antes da indução da periodontite(0.6 mg/kg); SRP/ASU00 Administração do ASU iniciada no dia da indução da periodontite; SRP/ASU+7 Administração do ASU iniciada no dia do tratamento da periodontite. A remoção da ligadura e a raspagem foram executados 7 dias após a indução da periodontite e os medicamentos foram administrados diariamente por gavagem até o sacrifício dos animais (7,15 e 30 dias). Foram executadas as mesmas análises utilizadas para o estudo da primeira hipótese. Para a avaliação da terceira hipótese, foram instalados 1 implante por tíbia em 30 ratos que foram randomicamente divididos em 3 grupos ASU1 Administração de ASU iniciada 7 dias antes de instalação dos implantes(0.6 mg/kg); ASU2 Administração de ASU iniciada no dia da instalação dos implantes; CTL Administração de SS iniciada no dia da instalação do implantes. Os medicamentos foram administrados diariamente por gavagem até o sacrifício dos animais (60 dias). Foram executadas análises radiográficas, biomecânicas, histomorfométrica (Contato osso-implante(%BIC) e área de osso entre as roscas(%BBT), histológica descritiva e imunohistoquímica (BMP2, TGFß1 e Osteocalcina). Para avaliação da quarta hipótese foram executados defeitos críticos em calotas (DCC-5mm) de 84 ratos que foram randomicamente divididos em 2 grupos CTR-Administração de SS e ASU Administração de ASU(0.6 mg/kg). Adicionalmente os animais foram divididos em 3 subgrupos de acordo com o biomaterial utilizado para preencher o defeito COA-Defeito preenchido com coágulo; OBD-Defeito preenchido com osso bovino desproteinizado; TCP/HA- Defeito preenchido com ß-fosfato tricálcio/Hidroxiapatita. A administração dos medicamentos foi iniciada 15 dias antes da confecção dos DCC e foram aplicados diariamente por gavagem até o sacrifício dos animais (15 e 60 dias). Foram executados análise microtomográfica (%osso e biomaterial), histologia descritiva e histomorfométrica (%osso, biomaterial e tecido conjuntivo). No estudo I foi verificado que os grupos ASU0 e ASU+7 apresentaram maiores porcentagens de tecido ósseo na região da furca e menores distâncias JCE-CO que o grupo CTR nos períodos de 7 e 15 dias. Adicionalmente foi verificada uma maior expressão de IL-1ß, RANKL e TRAP e menor expressão de fosfatase alcalina no grupo CTR em relação ao grupo ASU+7. No estudo II foi verificado que não houve diferenças entre os grupos com relação as análises histométrica e microtomográfica. Foi verificado uma maior expressão do RNAm de fosfatase alcalina no grupo SRP/ASU+7 em relação aos outros grupos aos 30 dias, e menor expressão do RNAm de RANKL nos grupos SRP/ASU0 e SRP/ASU+7 em relação aos grupos SRP e SRP/ASU-7 aos 15 dias. No estudo III os grupos de animais dos grupos ASU1 e ASU2 apresentaram maiores valores de %BIC na região cortical e maior expressão de BMP2 e TGFß1 em relação ao grupo CTL. No estudo IV ocorreu uma maior formação óssea no grupo ASU em relação ao grupo CTR no subgrupo COA, porém não houve diferenças entre os grupos subgrupos OBD e a TCP-HA. Dessa forma pode-se concluir que o extrato de ósseo insaponificável de abacate e soja promoveu maior reparo na periodontite induzida em ratos, porém esses resultados não foram consistentes pois esse efeito não foi confirmado no modelo de tratamento da periodontite induzida. Esse medicamento induziu, de forma sutil uma aceleração da osseointegração de implantes e uma maior formação óssea associada a DCC que não foram preenchidos com biomateriais

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate in rats the effect of the avocado soybean unsaponifiables (ASU) on the bone repair in induced periodontitis, on the osseointegration of dental implants, and on the repair of the critical sized calvaria defects filled or no with biomaterials. For this purpose, the following hypothesis regarding the use of ASU were tested 1)Improve the periodontal repair in induced periodontitis; 2)Improve the periodontal repair after the treatment of the induced periodontitis; 3) Accelerate osseointegration; 4) Improve the integration of osteoconductors bone grafts in the critical size calvaria defects. For the evaluation of the first hypothesis, eighty-four animals were randomly assigned into four equally-sized groups, receiving daily by gavage either sterile saline (CTR) or ASU (0.6 mg/kg), starting either 7 days prior to- (ASU/-7), or on the day- (ASU/0), or 7 days after (ASU/+7) periodontitis induction. Periodontitis was induced by placing silk ligatures into the gingival sulcus of the second maxillary molars for 7 days; thereafter the ligatures were removed. Seven animals from each group were euthanized at 7, 15 or 30 days after ligature removal. Bone resorption was evaluated by histomorphometry and micro CT. Immunohistochemistry was used to evaluate TRAP, RANKL, Alkaline phosphatase and qPCR to evaluate IL-1ß, TNF-α, IL-6, RANKL, Alkaline phosphatase (AP). For the evaluation of the second hypothesis, periodontitis was induced in 84 rats via ligature placement around the second upper molar, which was removed after 7 days, and scaling was performed at this time. Subsequently, the rats were randomly allocated to four groups with 21 animals each One in which saline solution (SS) was administered (SRP) and three in which ASU was administered (0.6 g/kg/day), beginning either 7 days before the induction of periodontitis (SRP/ASU-7), on the day of periodontitis induction (SRP/ASU0), or on the day of treatment (SRP/ASU+7). The ASU and SS were administered daily by gavage until the sacrifice of the animals (7, 15, and 30 days). The analysis performed was the same of the evaluation of the first hypothesis. For the evaluation of the third hypothesis, thirty rats were randomly assigned into one of three equal-sized groups 1) ASU1; administration of ASU, starting 7 days prior to implant installation, 2) ASU2; administration of ASU, starting on the day of implant installation, and 3) CTL; administration of saline solution. In all animals, one titanium implant was placed in each tibia. All animals received ASU or saline solution by gavage daily until sacrifice 60 days post-operatively. Implant osseointegration and bone maturation were assessed by biomechanical analysis, radiographic bone density, descriptive histology, immunohistochemical analysis for bone morphogenetic protein 2 (BMP2), transforming growth factor beta 1 (TGFß1), and osteocalcin (OCN), histomorphometric evaluation of bone-to-implant contact (BIC) and mineralized bone area fraction within the threads of the implant (BA). For the evaluation of the forthy hyphotesis, one critical sized calvaria defect (CCD-0.5 mm) was made in each of 84 rats. These defects were filled with coagulum (COA), deproteinized bovine bone (DBB), and ß-tricalcium phosphate/hydroxyapatite (TCP/HA). ASU (0.6 g/kg) or saline solution (CTR) was administered daily by gavage from 15 days before surgery until the animals were euthanized 15 or 60 days after surgery (7 animals per period/group). The description and composition of the tissues that filled the CCDs were analyzed by micro CT and histomorphometry. It was showed in the study I that the histomorphometry and micro CT showed larger bone resorption in the CTR than in the ASU/0 (15 days), and ASU/+7 (7 and 15 days). CTR presented also with a higher expression of TRAP (15 and 30 days) and RANKL (7 and 15 days) comparing to ASU/0 and ASU/+7. Similarly, qPCR showed higher levels of RANKL and IL1ß and lower levels of AP in CTR comparing with all other groups (All periods). In the study II, the SRP/ASU+7 presented higher expression of the alkaline phosphatase than all the other groups at 30 days. The SRP/ASU0 and SRP/ASU+7 groups presented lower expression of RANKL mRNA than the groups SRP e SRP/ASU-7 at 15 days. However, there were no differences between the groups regarding the percentage of bone fill and in the expression of the proteins. In the study III, ASU1 and ASU2 showed a 3- and 9- times higher expression of BMP2 and TGFß1, respectively, compared to CTL (p<0.05). Histomorphometric analysis, however, showed that both ASU1 and ASU2 groups presented significantly higher BIC values only in the cortical bone compartment when compared to CTL (p<0.05). In the study IV, the percentage of bone fill in the CCD of the COA-ASU group was significantly higher than that in the COA-CTR group at both evaluated time points (p<0.05). There were no differences regarding the percentage of bone between the DBB-ASU and DBB-CTR groups and the TCP/HA-ASU and TCP/HA-CTR groups at either time point (p<0.05). It can be concluded that the ASU can improve the repair of the induced periodontitis, but this effect was inconsistent since the ASU effects were not confirmed in the treatment of the induced periodontitis. ASU consumption has only a subtle effect on implant osseointegration and induced an enhancement in bone formation in the CCDs filled with coagulum