Efeitos da fotobioestimulação por laser e LED nas células da granulação óssea / Photobiomodulation effects by laser and LED in osseous granulation cells

RESUMO

A fotobioestimulação por laser e LED é uma tendência terapêutica inovadora e não invasiva. Os efeitos fotofísicos e fotoquímicos dessa terapia geram imunomodulação, aceleram a cicatrização e angiogênese, bem como reduzem a dor. Dessa forma tem se buscado o emprego desses estímulos no tecido ósseo, porém ainda inexistem padrões definidos para obter a melhor fotobioestimulação nas células ósseas. O objetivo desse trabalho foi avaliar a capacidade da fotobioestimulação na viabilidade celular e mineralização de células da granulação óssea de ratos (rGO). Células rGO na 6ª passagem foram plaqueadas em placas de 96 poços para os ensaios de viabilidade celular (1x10³) e em placas de 24 poços para os ensaios de cicatrização de feridas in vitro (1x104), mineralização e atividade da fosfatase alcalina (FALC) (4x104). As células receberam DMEM (10% SFB) e irradiações com laser (AlGaAs- 660nm e AlGaInP-810nm) e LED (637±15nm). Os grupos experimentais foram laser vermelho (3 e 5 J/cm²), laser infravermelho (3 e 5 J/cm²) e LED (3 e 5s), além dos grupos controles, positivo (C+) e negativo (C-, 1%SFB). Para os ensaios de mineralização e atividade de fosfatase alcalina, além do meio convencional, grupos com meio osteogênico e os mesmos tratamentos luminosos foram acrescentados. A viabilidade celular foi avaliada pelos testes do MTT e cristal violeta nos períodos de 24, 48, 72 e 96h. O ensaio de cicatrização de feridas in vitro foi avaliado por meio da porcentagem da área de fechamento da ferida nos períodos de 12, 24, 36, 48h. O teste de mineralização foi feito por meio do teste com vermelho de alizarina nos períodos de 14, 21 e 28 dias enquanto que a atividade da FALC foi medida em 7, 14 e 21 dias. A análise estatística foi realizada através dos testes ANOVA complementados por Tukey (p<0,05). Os resultados mostraram que as terapias com luz de maneira geral aumentaram a viabilidade o fechamento da ferida in vitro, principalmente os grupos laser vermelho e LED5s (p<0,05). Pode-se observar um bom desempenho do grupo LED5s no ensaio de mineralização, onde nos grupos que receberam meio osteogênico houve um efeito somatório com a ação da fotobioestimulação promovendo maior produção de nódulos in vitro. Também, as terapias com luz, estimularam a produção de nódulos mineralizados nos grupos que receberam meio convencional de forma a superar o C+ osteogênico (p<0,05), denotando uma ação de indução osteogênica a partir da fotobioestimulação. A fosfatase alcalina foi estimulada pelos tratamentos com luz no período de 7 dias (p<0,05). Em conclusão, as terapias com laser e LED foram capazes de estimular a viabilidade e migração celular e eventos de mineralização em osteoblastos, sendo que o laser vermelho e LED promoveram os melhores resultados.(AU)

ABSTRACT

Photobiomodulation by laser and LED is a new therapeutic non-invasive trend. Photophysical and photochemical effects occur in immunomodulation, acceleration of wound healing and angiogenesis and reduction of pain. These effects are desired in bone tissue but there are no defined parameters for light irradiation and no consensus for the best effect on osseous cells. The aim of this study was to evaluate photobiomodulation effects on cell viability and mineralization events of rat osseous granulation cells (rGO). Cells in 6th passage were plated in 96-well plates for viability tests (1x10³ cells), and 24-well plates for in vitro wound healing test (1x104 cells), mineralization and alkaline phosphatases (AF) activity (4x104 cells). Cells were cultured in DMEM (10% bovine fetal serum) and irradiation with lasers (AlGaAs-660nm e AlGaInP-810nm) and LED (637±15nm). Experimental groups were red laser (3 and 5 J/cm²), infrared laser (3 and 5 J/cm²), LED (3 and 5s), positive(C+) and negative controls (C-, 1% bovine fetal serum). For mineralization and AF assays, other groups with osteogenic medium and same light treatments were added. Cell viability was evaluated by MTT and crystal violet tests at 24, 48, 72 and 96h. In vitro wound healing test evaluated the percentage of wound closure area by cells migration at 12, 24, 36, 48h. Mineralization test was done by alizarin red at 14, 21 and 28 days. AF activity was measured at 7, 14 and 21 days. Statistical analysis was performed by ANOVA complemented by Tukeys test (p<0,05). Results showed that light therapies in general increased viability and wound healing closure, mostly red laser and LED5s (p<0,05). Best results in mineralization stimulation were observed for LED5s. In groups with osteogenic medium, a synergistic effect of photobiomodulation resulted in higher numbers of mineral nodules. Light groups stimulated higher mineral nodule formation than positive control (p>0.05) even in groups with regular medium, showing an osteogenic induction by light. Increased AF activity was observed at 7 days in light treatment groups (p<0,05). In conclusion, laser and LED photobiostimulation increased viability, cell migration and mineralization events in osteoblasts with best results for red laser and LED.(AU)