Efeito de flavonoides sobre microrganismos de interesse endodôntico e sua influência na expressão de marcadores de mineralização / Effect of flavonoids on endodontic microorganisms and their influence on the expression of mineralization markers

RESUMO

O tratamento endodôntico de dentes permanentes jovens representa um grande desafio clínico devido a presença de paredes dentinárias finas, divergentes ou paralelas e ápice aberto, o que dificulta a desinfecção e a execução dos procedimentos convencionais. Terapias de regeneração endodôntica envolvem o uso de materiais capazes de promover uma desinfecção eficaz sem causar citotoxicidade, além de induzir a diferenciação de células-tronco ou bioestimular células remanescentes do tecido pulpar mesmo após a injúria. Nesse contexto, os flavonoides, polifenóis presentes em frutas e vegetais, poderiam ser agentes interessantes para o tratamento endodôntico de dentes imaturos devido a sua amplitude terapêutica. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito antimicrobiano, citotóxico e indutor de mineralização de flavonoides com finalidade de aplicação endodôntica. Este trabalho de tese foi dividido em três capítulos. O capítulo 1 avaliou a toxicidade dos flavonoides taxifolina, crisina, pinocembrina e galangina sobre fibroblastos pelo ensaio de MTT, a atividade antimicrobiana pela determinação da concentração inibitória e bactericida mínima, e a ação antibiofilme do flavonoide com melhor efeito antimicrobiano, por meio de ensaios em placas de poliestireno e em dentina radicular bovina por meio da análise por microscopia confocal. Os resultados mostraram que o flavonoide taxifolina não foi tóxico para os fibroblastos em nenhuma das concentrações analisadas, enquanto que os flavonoides crisina, pinocembrina e galangina apresentaram efeitos citotóxicos. Crisina, pinocembrina e galangina não apresentaram efeito antimicrobiano frente E. faecalis and S. mutans nas concentrações testadas. A taxifolina foi capaz de inibir todas as bactérias testadas, eliminar biofilmes de E. faecalis e S. mutans em placas de poliestireno e reduzir significantemente o biofilme de E. faecalis em túbulos dentinários. O capítulo 2 avaliou a citotoxicidade do flavonoide taxifolina e o seu potencial sobre a indução de marcadores de mineralização dentinária (produção de fosfatase alcalina - ALP, nódulos de mineralização ­ NM e expressão dos genes DSPP ­ sialofosfoproteína dentinária e DMP-1 ­ proteína da matriz dentinária - 1) em células semelhantes a odontoblastos MDPC-23, após tratamentos de 24, 72h e contínuo. A taxifolina não apresentou citotoxicidade em nenhum dos três tipos de tratamento analisados. Todas as concentrações do tratamento de 24h e as concentrações de 10 e 5µM do tratamento de 72h aumentaram a atividade de ALP. A formação de NM aumentou com os tratamentos de taxifolina à 10µM em ambos os tratamentos de 24 e 72h, e à 5µM no tratamento de 24h. A expressão de DMP-1 aumentou com o tratamento de taxifolina em ambos os tratamentos de 24 e 72h, enquanto que a de DSPP aumentou apenas com o tratamento de 72h na concentração de 5µM. O capítulo 3 avaliou a citotoxicidade da taxifolina, e o seu potencial sobre a indução de marcadores de mineralização óssea (ALP, NM e expressão dos genes ALP e colágeno 1 - Col-1) em células semelhantes a osteoblastos Saos-2, após tratamentos de 24, 72h e contínuo. Os resultados mostraram que os tratamentos com taxifolina nas concentrações de 10, 5 e 1µM não foram citotóxicos em nenhum dos períodos analisados. O tratamento de 72h da taxifolina à 10µM foi capaz de aumentar a atividade de ALP e a formação de NM, além de aumentar a expressão de Col-1 após 13 dias. O tratamento de 24h da taxifolina na concentração de 10µM aumentou a expressão de ALP após 6 dias. Conclui-se que a taxifolina é um flavonoide com potencial uso para o tratamento endodôntico de dentes permanentes jovens, devido à sua ação antimicrobiana/antibiofilme, baixa citotoxicidade e capacidade de estimular a mineralização em odontoblastos e osteoblastos(AU)

ABSTRACT

The endodontic treatment of young permanent teeth represents a great clinical challenge due to the presence of thin, divergent or parallel dentin walls and the open apex that makes it difficult to disinfect and perform conventional endodontic procedures. Endodontic regeneration therapies involve the use of materials capable of promoting effective disinfection without causing cytotoxicity, in addition to inducing differentiation of stem cells or biostimulating remaining pulp tissue cells even after injury. In this context, the flavonoids, polyphenols present in fruits and vegetables, could be interesting agents for the endodontic treatment of immature teeth due to the wide therapeutic use. Thus, the objective of the present study was to evaluate the antimicrobial, cytotoxic effects and capacity of mineralization induction of flavonoids for endodontic application. This thesis was divided into three chapters. The chapter 1 evaluated the toxicity of taxifolin, chrysin, pinocembrin and galangin flavonoids on fibroblasts by the MTT method, antimicrobial activity by determining the minimum inhibitory and bactericidal concentrations and analyzed the antibiofilm action of the flavonoid with the best antimicrobial effect, by means of the biofilm assays in polystyrene plates and in bovine root dentin and confocal microscopy analysis. The results showed that the flavonoid taxifolin was not toxic on fibroblasts in any tested concentration, while chrysin, pinocembrin and galangin flavonoids showed cytotoxic effects. Chrysin, pinocembrin and galangin showed no antimicrobial effect against E. faecalis and S. mutans in any tested concentrations. Taxifolin was able to inhibit all tested bacteria, to eliminate E. faecalis and S. mutans biofilms on polystyrene plates and significantly reduce E. faecalis biofilms from the dentin tubules. The chapter 2 evaluated the cytotoxicity of taxifolin and its potential on the induction of dentin mineralization markers (alkaline phosphatase production - ALP, mineralization nodules - MN and expression of genes DSPP - dentin sialophosphoprotein and DMP-1 - dentin matrix protein - 1) on odontoblast-like cells MDPC-23, after treatments of 24, 72h and continuous. Taxifolin did not present cytotoxicity at any of the three types of treatments analyzed. All concentrations of 24h-treatment and 10 and 5µM of 72htreatment increased ALP activity. NM formation increased with taxifolin treatments at 10µM in both 24 e 72h treatments, and at 5µM in the 24h-treatment. Expression of DMP-1 increased with taxifolin in both 24 e 72h-treatments, whereas DSPP expression increased only with 72h-treatment at 5µM. The chapter 3 evaluated the cytotoxicity of taxifolin and its potential on the induction of bone mineralization markers (ALP, NM and expression of ALP and collagen 1 -Col-1 genes) on Saos-2 osteoblast-like cells, after treatments of 24, 72h and continuous. The results showed that taxifolin treatments at 10, 5 and 1µM were not cytotoxic in any of the periods analyzed. The 72h-treatment of taxifolin at 10µM was able to increase ALP activity and NM formation, in addition to increasing Col-1 expression after 13 days. The 24h-treatment of taxifolin at 10µM increased ALP expression after 6 days. It is concluded that taxifolin is a flavonoid with potential use for endodontic treatment of young permanent teeth due to its antimicrobial/antibiofilm action, low cytotoxicity and ability to stimulate mineralization in odontoblasts and osteoblasts(AU)