Eficacia de la terapia génica antisentido utilizando oligonucleótidos anti K-ras y antitelomerasa en cáncer colorrectal / Antisesnse gene therapy using anti-k-ras and antitelomerase oligonucleotides in colorectal cancer

RESUMEN

Objetivo: evaluar la eficacia de oligonucleótidos anti k-ras yantitelomerasa para detener el crecimiento tumoral en el cáncercolorrectal.Material y métodos: se ha empleado una línea celular establecidade cáncer colorrectal humano (SW 480, ATTC®). Los oligodesoxirribonucleótidos(ODN) utilizados en el presente trabajo presentanmodificación fosforotioato con el fin de mejorar su estabilidad enpresencia de fluidos biológicos. Hemos utilizado un ODN antitelomerasa(Telp5), y dos ODN anti k-ras (AS-KRAS e ISIS). AS-KRAS actúaen el exón 1 e ISIS actúa a nivel de la unidad terminal de transcripción5’ del oncogen k-ras. Telp5 se une a la subunidad hTR de latelomerasa. Se han aplicado en concentraciones 1, 5, 10 y 20 micromolar,midiendo la viabilidad celular a las 48 y 72 horas de tratamiento.El análisis estadístico y el diseño de los gráficos se han realizadomediante el programa “Analyzing Data with GraphPadPrism-1999”. GraphPad Sofware Inc., San Diego CA©. Para el tratamientoestadístico se ha utilizado el test t de Student.Resultados: la dosis mínima (1 µM) no fue efectiva ni a 48 nia 72 horas postratamiento. Con la dosis máxima (20 µM durante48 horas) y utilizando la combinación de AS-KRAS y Telp5 obtuvimosuna reducción de la viabilidad celular del 99,67%. El restode resultados fueron intermedios, dependiendo del tipo de oligonucleótidoempleado, la dosis y el tiempo de exposición.Conclusiones: los oligonucleótidos antisentido probados detienenel crecimiento celular en el cáncer colorrectal, siendo larespuesta más eficaz la combinación de ambos y aumentando dichaeficacia con mayor dosis y tiempo de exposición

ABSTRACT

Aim: to test the efficacy of anti-k-ras and antitelomeraseoligonucleotides for disabling colorectal cancer cell growth.Material and methods: an established human colorectalcancer cell line (SW 480, ATTC®) was used. Oligodeoxiribonucleotides(ODNs) have a phosphorotioate modification to ensureintracellular intake. We used an antitelomerase ODN (Telp5) andtwo anti-k-ras ODNs (AS-KRAS and ISIS). AS-KRAS is designedto join the k-ras oncogene’s exon 1. ISIS links to the terminaltranscription unit 5’ of k-ras. Telp5 joins the template region ofthe hTR telomerase subunit. ODNs have been tested in differentconcentrations (1, 5, 10, 20 micromolar). Cell viability has beentested at 48 and 72 hours. Statistical analysis and graphic designwere made with the statistical package “Analyzing Data withGraphPad Prism-1999”, GraphPad Sofware Inc., San DiegoCA©. We used the Student’s t test for statistical analysis.Results: the lowest dose (1 µM) was not effective. Using thehighest dose (20 µM for 48 hours) of combined AS-KRAS andTelp5 cell viability decreased to 99.67%. The rest of results varieddepending on ODN type, dose, and exposure time.Conclusions: tested antisense ODNs stop colorectal cancercell growth, and a combination of anti-telomerase and anti-k-ras isthe most useful treatment. Efficacy is best with a higher dose andlonger treatment period