Selección de genes de referencia en semen equino criopreservado para su uso en estudios de expresión genética con la técnica de PCR cuantitativa / Reference genes selection in cryopreserved equine semen for its use in studies of gene expression with the quantitative PCR technique

RESUMEN

INTRODUCCIÓN: La gestión de bancos de germoplasma implica la conservación y uso de dosis seminales, pero también pueden ser una fuente de estudio sobre la calidad de los sementales y las propiedades del semen para su empleo post descongelación. Un criterio para medir la calidad seminal puede basarse en las diferencias de expresión de algunos genes implicados en la espermatogénesis y la maduración espermática. OBJETIVO: Análisis de genes expresados en semen equino criopreservado que ofrezcan una adecuada amplificación, especificidad y estabilidad para su empleo como genes de referencia en futuros estudios de expresión genética. MATERIAL Y MÉTODOS: Purificación de espermatozoides vivos mediante un gradiente de concentración discontinua a partir de pajuelas de semen criopreservado correspondiente a cuatro sementales. Extracción orgánica de ácidos ribonucleicos con tratamiento con la enzima desoxiribonucleasa y la amplificación selectiva de siete genes candidatos mediante retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real en un solo paso. RESULTADOS: Tres de los genes seleccionados, β-Actina, Ubiquitina B y proteína Ribosomal L32 se amplifican correctamente. β-Actina, Ubiquitina B manifiestan la mayor estabilidad. CONCLUSIÓN: En los espermatozoides procedentes de muestras de semen criopreservado equino se puede detectar la presencia de ARNm, siendo el gen de la β-Actina y de la Ubiquitina B los más indicados como genes de referencia de los siete candidatos analizados

ABSTRACT

INTRODUCTION: The germoplasm bank management involves the conservation and use of semen doses, but can also be a source of study on the quality of stallions and semen properties for use after thawing. A criterion for measuring the semen quality may be based on differences in expression of some genes involved in spermatogenesis and sperm maturation. OBJECTIVE: Analysis of genes expressed in equine cryopreserved sperm that can provide adequate amplification, specificity and stability for use as future reference genes in gene expression studies. MATERIAL AND METHODS: Purification of live sperm through a discontinuous concentration gradient from cryopreserved semen straws corresponding to four stallions. Organic extraction of ribonucleic acids with deoxyribonuclease treatment and the selective amplification of seven candidate genes using a retrotranscription and a real time chain reaction of the polymerase in one step mode. Specificity is tested by melting curves and agarose gel electrophoresis. Also the stability of the genes is calculated. RESULTS: Three of the selected genes, β-actin, Ubiquitin B and Ribosomal protein L32 were properly amplified. β-Actin and Ubiquitin B showed the best stability. CONCLUSION: mRNA was amplified from equine cryopreserved semen samples, being the β-Actin and the Ubiquitin B genes the most suitable reference genes of the seven candidates analyzed