Effect of etoricoxib, a cyclooxygenase-2 selective inhibitor on aberrant cryptformation and apoptosis in 1,2 dimethyl hydrazine induced colon carcinogenesis in rat model / Efecto del etoricoxib, un inhibidor selectivo de la ciclooxigenasa-2, sobre la formación de criptas aberrantes y la apoptosis en un modelo murino de carcinogénesis de colon inducidad por 1,2-dimetilhidracina

ABSTRACT

Etoricoxib, a second generation selective cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitor had been studied for the chemopreventive response at its therapeutic anti-inflammatory dose in 1,2-dimethylhydrazine (DMH) induced colon carcinogenesis in rat model. Eight to ten weeks old male rats of Sprague-Dawley strain were divided into four groups. While group 1 served as control and received the vehicle of the drugs, group 2 and 3 were administered freshly prepared DMH in 1mM EDTA-saline (pH 7.0) (30 mg/kg body wt/week, subcutaneously). Group 3 was also given a daily treatment of etoricoxib (0.6 mg/kg body wt orally) while the group 4 received the same amount of etoricoxib only, prepared in 0.5% carboxymethyl cellulose. Animals were sacrificed at the end of 6 weeks, body weight recorded and the colons were subjected to macroscopic and histopathological studies. The maximum number of raised mucosal lesions called the multiple plaque lesions (MPL) were found in the DMH group which significantly reverted back in the DMH + etoricoxib group, while very few MPLs were recorded in the control and etoricoxib only group. Similarly, the number of aberrant crypt foci (ACF), the point of future carcinogenic growth, was recorded more in the DMH group and significantly less in the DMH + etoricoxib group. The histopathological analysis showed the presence of severe hyperplasia, occasional dysplasia and aggregates of lymphoid cells in the localized regions. Etoricoxib group showed near normal histological features with the crypt architecture and the surrounding stromal tissue remaining intact. To ascertain the molecular mechanism of such anti-carcinogenic features the colonocytes were isolated and studied in primary culture for the evidence of apoptosis by fluorescent staining and genotoxic changes by single cell gel electrophoresis assay (comet assay) which shows that the DMH treated animals produced much less apoptotic nuclei but more comet producing cell, while these features were reverted back with the etoricoxib treatment. The cytoplasmic expression of COX-2 protein was studied in paraffin sections of the colon by immunohistochemistry with COX-2 specific antibody which showed a very high presence of this inducible enzyme with the DMH group while in all other groups of animals it was not visible or weekly expressed. The anti-inflammatory effect of the drug, etoricoxib was also validated by a carrageenan-induced inflammation in rat model which showed an extremely high anti-inflammatory response within the dose range used in the present study. Also the growth profile of all the animals remained the same throughout the six week period of the investigation as there was no change in the body weight. It appears that apoptosis remains the dominant anti-proliferative end effect of this drug, mediated by an inhibition of the proinflammatory COX-2 isoform although further molecular probings are needed to arrive at a conclusive agreement in favor of the chemoprotective use of such drugs in colon cancers (AU)

RESUMEN

El Etoricoxib, un inhibidor selectivo de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) de segunda generación, se ha estudiado por la respuesta quimiopreventiva a su dosis terapéutica antiinflamatoria en un modelo murino de carcinogénesis colónica inducida por 1,2-dimetilhidracina (DMH). Se dividió en cuatro grupos a ratas de la cepa Sprague-Dawley de ocho a diez semanas de vida. El grupo 1 sirvió de control y recibió el vehículo de los fármacos, y a los grupos 2 y 3 se les administró DMH recién preparada en EDTA-salino al 1 mM (pH 7,0) (30 mg/kg peso corporal/semana, subcutáneamente). El grupo 3 también recibió a diario tratamiento con etoricoxib (0,6 mg/kg peso corporal, por vía oral), mientras que el grupo 4 solamente recibió la misma cantidad de etoricoxib, preparado en 0,5% carboximetil celulosa. Se sacrificó a los animales al final de la sexta semana, se registró el peso corporal y se realizaron estudios macroscópicos e histopatológicos del colon. El número máximo de lesiones mucosas elevadas, denominadas lesiones en placa múltiples (LPM) se halló en el grupo DMH, y estaba significativamente normalizado en el grupo de DMH + etoricoxib, mientras que se hallaron muy pocas lesiones LPM en los grupos control y con sólo etoricoxib. De forma similar, el número de focos de criptas aberrantes (FCA), el punto del futuro crecimiento carcinogénico, se registró más abundantemente en el grupo DMH y menos significativamente en el grupo DMH + etoricoxib. El análisis histopatológico mostró la presencia de una hiperplasia marcada, displasia ocasional y agregados de células linfoides en las regiones localizadas. El grupo de etoricoxib mostró unas características histológicas casi normales, permaneciendo la arquitectura de las criptas y el tejido estromal vecino intacto. Para determinar el mecanismo molecular de tales hallazgos anticarcinogénicos, se aislaron los colonocitos y se estudiaron en un cultivo primario para evidencia de apoptosis mediante tinción fluorescente y cambios genotóxicos en un ensayo de electroforesis en gel de una única célula (ensayo comet), que mostró que los animales tratados con DMH produjeron muchos menos núcleos apoptóticos pero un mayor número de células productoras de comet, mientras que estos cambios revirtieron con el tratamiento con etoricoxib. Se estudió la expresión citoplásmica de la proteína COX-2 en las secciones en parafina del colon mediante inmunohistoquímica con un anticuerpo específico anti-COX-2 que mostró una presencia muy alta de esta enzima inducible en el grupo DMH mientras que en el resto de los grupos de animales apenas se expresó o no se visualizó. Efecto antiinflamatorio del fármaco el etoricoxib también se validó en modelo murino de inflamación inducida por carragenina que mostró una respuesta antiinflamatoria extremadamente alta dentro del rango de dosis empleado en este estudio. El perfil de crecimiento de los animales permaneció inalterado durante las seis semanas que duró la investigación y no hubo cambios en el peso corporal. Parece que la apoptosis sigue siendo el efecto antiproliferativo final dominante de este fármaco mediado por la inhibición de la isoforma proinflamatoria de la COX-2, si bien se necesitan probandos moleculares adicionales para llegar a un acuerdo concluyente a favor del uso quimiopreventivo de tales fármacos en los cánceres de colon (AU)