Evaluación de la recombinasa reca sobre la unión espermatozoide-ADN exógeno en la transgénesis mediada por espermatozoides en la especie porcina / Evaluation of boar sperm-RecA: ssDNA complex interaction

RESUMEN

La transgénesis mediada por espermatozoides (SMGT) es un método de producción de animales transgénicos.Se basa en la capacidad que presentan los espermatozoides de unir ADN exógeno y transferir el transgén a los ovocitos. Por otro lado, la proteína recombinasa de origen bacteriano RecA protege las cadenas simples de ADN de la degradación, al crear una capa protectora. Este hecho da lugar a una mayor producción de embriones viables e integración del transgén en animales producidos mediante microinyección pronuclear e ICSI. El objetivo de este estudio fue investigar la capacidad de transferencia de los complejos RecAssADN en espermatozoides de cerdo, así como la viabilidad de los mismos mediante citometría de fl ujo. En primer lugar, se recolectó el semen y se centrifugó para eliminar el plasma seminal. Se utilizó el plásmido EGFPque fue incubado con los espermatozoides a 16º C (grupo control). Para el grupo RecA, en primer lugar se desnaturalizó el ADN (95ºC, 5 min) y seguidamente, se incubó con la proteína RecA en hielo durante 1h,transcurrido este tiempo estos complejos (RecAssADN) formados se incubaron con los espermatozoides a16ºC. La incubación en presencia de la recombinasa RecA supuso un aumento signifi cativo del porcentajede células unidas al ADN con respecto a espermatozoides intactos incubados únicamente con el gen EGFP(AU)

ABSTRACT

Sperm mediated gene transfer (SMGT) is an interesting tool for animal transgenesis consisting on theuse of sperm cells as a vector for transmitting exogenous DNA into eggs at the moment of fertilization. Onthe other hand, RecA, a bacterial recombinase, was shown to protect DNA from degradation by creating aprotective coating during its binding to it and resulted in higher embryo survival and transgenic integrationfrequencies in mice produced by ICSI. The objective of this study was to investigate the capacity of transferenceof RecAssDNA complex by pig spermatozoa by measuring the sperm DNA-binding ability and viability byfl ow cytometry. Semen was recovered and centrifuged, discarding the seminal plasma. Linealized plasmidDNA was added to sperm and incubated at 16ºC (control group). In RecA group, DNA was denatured (95ºC, 5min) and incubated with RecA on ice for 1h, then mixed with sperm. RecA group sperm signifi cantly increasedDNA-binding capacity compared to control group semen after 120 min (Control 19.68±0.73% vs. RecA24.69±0.70%; p<0.01). Exogenous DNA bound mainly to spermatozoa with reduced viability in all the groupsof spermatozoa evaluated (Control 19.21±0.71% vs. RecA 24.11±0.69%; p<0.01). In consequence, only a lowpercentage of living spermatozoa was bound to DNA (Control 0.47±0.09% vs. RecA 0.58±0.09%; p=0.40).In this study we have demonstrated that the complex RecAssDNA bind with the pig sperm in a higher relationthan sperm incubated only with the transgene, and in both cases the binding is associated mainly with nonviablecells. Therefore, the SMGT technique could combines with assisted reproductive techniques such asICSI to obtain embryos and transgenic piglets(AU)