Identificação e tipagem de enterococcus SSP através de técnicas genotípicas / Identify and typing Enterococcus SSP by genotypes techniques

RESUMO

A diferenciação dos enterococos, através de técnicas fenotípicas, é uma tarefa difícil devido a sobreposição de características bioquímicas entre algumas espécies. A limitação destas técnicas, tem levado a utilização de métodos genotípicos baseados no estudo do DNA. Neste estudo, métodos moleculares, empregados para detecção de polimorfismo genético incluindo; sequenciamento de DNA, técnica de PCR, utilizando-se diferentes oligonucleotídeos, e PFGE, foram utilizados para identificação e tipagem de enterococos. Através da técnica de PCR a região do DNA genômico compreendida entre as bases 1390 e 288, respectivamente dos genes l6S e 23S, foi amplificada para l l diferentes espécies de enterococcus, representadas por amostras ATCC. Entre as espécies ensaiadas observou-se a presença de dois a quatro fragmentos com peso molecular variando entre 6OObp e lkb. Perfíl diferenciado foi obtido para Efaecium. As amostras de E.gallínarum, E.hírae e E.casselíflavus, E.raffínosus apresentaram bandas extras de baixo peso molecular que, entretanto, não foram conclusivas na diferenciação destas espécies. As demais espécies mostraram padrões similares tornando a diferenciação difícil. Para E.faecíum e E.faecaíís, respectivamente, constatou-se a presença de dois fragmentos de cerca de 600 e 7OObp . Estes fragmentos tiveram sua sequência determinada para S cepas de E.faecium e l de E.faecaíis. O alinhamento das sequências de Efaecium entre si, e com a ATCC de número 19434, estocada no Genbank demonstrou alto grau de homoiogia. Alto grau de homoiogia também foi verificado entre a sequência de E.faecafís e outra, da mesma espécie, também estocada no banco de sequências. A tipagem das cepas de E.faecium e E.faecalís, de origem clínica, foi realizada através da técnica de REP-PCR, PCR empregando-se os oiigonucleotídeos desenhados da sequência de E.faecíum obtida neste estudo, e PFGE. A heterogeneidade genética entre os isoladas foi demonstrada através das metodologias empregadas. Não se observou diferença no poder discriminatório entre as técnicas adotadas. No agrupamento de cepas, por similaridade, não houve correlação entre as técnicas. Um oligonucleídeo, desenhado da região intergênica da sequência de E.faecium, empregado isoladamente, demonstrou homologia para o DNA de todas as espécies ensaiadas