Estudos estruturais e funcionais dos inibidores de proteases Bdellastasina e Ghilantina da família das antistasinas / Structural and functional studies on the antistasin family inhibitors, Bdellastasin and Ghilanten

RESUMO

Sanguessugas e outros animais hematófagos têm sido descritos como fonte d diversas Proteínas com propriedades anticoagulantes. Algumas destas proteína fazem parte da família Antistasina de inibidores de proteases. Ghilantina bdellastasina são membros desta família com atividade inibitória sobre fator Xa plasmina, respectivamente. O primeiro objetivo deste trabalho foi concluído com o estabelecimento do sistema de expressão em Pichia pastoris da proteína bdellastasina. O êxito obtido na expressão do inibidor demonstrou que o sistema poderia, em princípio, ser usado na expressão de outras proteínas da família. O sistema mostrou-se eficiente não somente pelo bom nível de expressão da proteína heteróloga, mas também pela facilidade de purificação. O estudo das relações estrutura-função que definem as especificidades das interações enzima-inibidor entre fator Xa e ghilantina foram alvo da segunda parte deste trabalho. Para tal, foram produzidos híbridos da bdellastasina substituindo-se regiões desta por outras da ghilantina, supostamente responsáveis pela interação com O fator Xa, com a finalidade de produzir um inibidor de fator Xa. Foram construídos cinco híbridos bdellastasina-ghilantina baseados em dados de estrutura primária e especificidade e posteriormente mais seis variantes baseados em dados da estrutura tridimensional dos inibidores antistasina e bdellastasina. A construção destes últimos teve como objetivo a introdução na bdellastasinà dos resíduos da ghilantina responsáveis pela interação com o exosítio do fator Xa, além de alterar a conformação global da bdellastasina para permitir uma interaçâo adequada. A construção dos mutantes foi feita por síntese de genes, cassete mutagênese e técnicas de PCR e a expressão realizada em Pichia pastoris com subseqüente purificação e estudos funcionais. Os híbridos produzidos, com exceção dos mutantes SRY, mantiveram a capacidade e inibição de tripsina, mas não apresentaram nenhum efeito sobre o fator Xa. Considerando-se que grandes regiões foram substituídas, é razoável pensar que a estrutura terciária final dos híbridos apresente impedimento no ajusto perfeito da enzima com o inibidor. Na última parte deste trabalho foram estudadas as funções dos domínios isolados da ghilantina na atividade global do inibidor. Com este propósito os genes da ghilantina e de seus domínios isolados foram construídos e expressos em P. pastoris....(au)