Envolvimento da CaMKII no efeito proliferativo do heme(Fe-Protoporfirina IX)em Trypanosoma cruzi / Envolvement of the CaMKII in the proliferativo effect of the heme(Fe-Protoporfirina IX)em Trypanosoma cruzi

RESUMO

O Trypanossoma cruzi é o agente etiológico da Doença de Chagas, que é transmitida através de insetos vetores triatomíneos durante a alimentação no hospedeiro vertebrado. A doença de Chagas é um grave problema na América Latina, e apesar disso a quimioterapia existente para a doença ainda não é satisfatória, sendo pouco eficaz em seus estágios avançados, além de ser extremamente tóxica para o hospedeiro. Os triatomíneos chegam a ingerir em sangue, de 6 a 12 vezes o seu peso original, ingerindo numa única alimentação cerca de 10 mM de heme ligado à hemoglobina. Como a forma epimastigota de T. cruzi vive em constante presença de heme, começamos a investigar sua participação na proliferação do parasito como molécula sinalizadora. No presente trabalho testamos diversos inibidores de proteínas quinases in vitro. Somente o KN93 (2M), inibidor de quinases dependentes de Ca2+/CaM (multifuncionais), teve um efeito inibitório da ação do heme, enquanto os demais inibidores não alteraram a proliferação destas células. Quando utilizado o KN92, um análogo sem atividade inibitória, este não apresentou efeito, mostrando então a especificidade do KN93. A fim de identificar qual CaMK está envolvida na proliferação mediada por heme, testamos o peptídeo Myr-AIP, um inibidor altamente específico e potente, derivado do substrato da CaMKII, e observamos que a adição do inibidor na cultura bloqueou a proliferação dos parasitos na presença de heme, confirmando o efeito específico sobre a proliferação mediada por heme, e o envolvimento da via da CaMKII. Através da técnica de western blotting mostramos o aumento da fosforilação da CaMKII na presença de heme, confirmando o envolvimento da CaMKII nesse processo. Posteriormente, ensaiamos a atividade da CaMKII utilizando uma CaMKII recombinante comercial. Vimos que a adição de heme 300 ?M no meio de reação aumentou a atividade enzimática cerca de 10 vezes, corroborando o resultado obtido no western blotting, e sugerindo a existência de dif...