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Triagem de mutação no éxon 3 do gene IRF6 em indivíduos com fissura labiopalatina e agenesia dentária: padronização de protocolo para seqüenciamento de DNA genômico a partir de saliva / Screening of mutation in IRF6 gene of subjects with cleft lip and palate and tooth agenesis: protocol standardization for sequencing of genomic DNA extracted from saliva
Bauru; s.n; 2009. 103 p. ilus, tab, graf.
Tese em Português | LILACS, BBO - Odontologia | ID: lil-557734
Biblioteca responsável: BR28.1
Localização: BR28.1
RESUMO
A fissura labiopalatina e a agenesia dentária são consideradas alterações do desenvolvimento embrionário. Esses fenótipos ocorrem em decorrência da interação de fatores genéticos e ambientais, caracterizando um padrão de herança multifatorial. Entre os genes candidatos a esses fenótipos destaca-se o IRF6. Para esses estudos genéticos podem ser usadas diferentes metodologias, dentre elas o seqüenciamento direto. A proposta deste estudo foi primeiramente padronizar um protocolo para seqüenciamento direto de DNA genômico a partir de saliva e então investigar mutações ou polimorfismos no éxon 3 do gene IRF6 em indivíduos com fissura de lábio e palato unilateral não-sindrômica e agenesia dentária. Fizeram parte do estudo 120 voluntários distribuídos em quatro grupos Grupo 1 30 indivíduos com fissura e agenesia dentária; Grupo 2 - 30 indivíduos somente com fissura; Grupo 3 - 30 indivíduos somente com agenesia dentária e Grupo 4 - Controle. Para análise do éxon 3 do gene IRF6 foi coletada saliva, e a partir desse material foram testados três protocolos para extração de DNA genômico. Além disso, durante a padronização do protocolo para seqüenciamento direto foram avaliadas metodologias diferentes para outras três etapas da preparação das amostras purificação do produto de PCR, otimização na utilização do BigDye® v3.1 Terminator na reação de seqüenciamento e purificação do produto da reação de seqüenciamento. As amostras foram seqüenciadas em Analisador Genético ABI 3130XL e os resultados analisados por meio de programas de computador específicos. Foram pesquisadas, nos eletroferogramas referentes ao éxon 3 do gene IRF6, variações nas seqüências de cada indivíduo. Os resultados mostraram que o protocolo de extração de DNA a partir de saliva utilizando InstaGeneTM Matrix associado à proteinase K e dodecil sulfato de sódio 1% foi o que apresentou melhores resultados na quantidade e qualidade do DNA extraído. Em relação à purificação do produto de PCR, o método de...
ABSTRACT
Cleft lip and palate and tooth agenesis are considered changes in embryonic development. These phenotypes occur as a result of the interaction of genetic and environmental factors, suggesting a multifactorial inheritance pattern. Among the candidate genes for these phenotypes IRF6 appears as one of the most important. Direct sequencing, among other techniques, can be used to perform such genetic studies. The aim of this study was to standardize a protocol for direct sequencing of genomic DNA extracted from whole saliva to allow further search of mutations or polymorphisms in exon 3 of IRF6 gene in individuals with nonsyndromic cleft lip and palate and tooth agenesis. Volunteers were 120 subjects divided into four groups Group 1 - 30 individuals with tooth agenesis and cleft, Group 2 - 30 individuals with cleft only, Group 3 - 30 individuals with tooth agenesis only, and Group 4 - Control. For the analysis of the exon 3 of IRF6 gene, saliva was collected to test three protocols for the extraction of genomic DNA. Additionally, during the protocol standardization for direct sequencing, different methodologies for the other three steps of sample preparation were evaluated purification of PCR product, optimization of the use of BigDye® v3.1 Terminator, and purification of the sequencing product. The samples were sequenced on ABI 3130XL Genetic Analyzer, and the results were analyzed using specific softwares. Heterozygous and homozygous variations in the sequences of the exon 3 of IRF6 gene of each individual were searched in the electropherograms. The results showed that the protocol for DNA extraction from saliva using InstageneTM Matrix associated with proteinase K and 1% sodium dodecyl sulfate showed the best results in the quantity and quality of the extracted DNA. As far as the purification of the PCR product, the method of choice was the purification in specific columns. BigDye® v3.1 was used with success in a volume 2 L per reaction, and the purification...
Assuntos

Texto completo: Disponível Coleções: Bases de dados internacionais Base de dados: BBO - Odontologia / LILACS Assunto principal: Saliva / Fenda Labial / Fissura Palatina / Análise de Sequência de DNA / Fatores Reguladores de Interferon / Anodontia Tipo de estudo: Estudo diagnóstico / Estudo de rastreamento Limite: Humanos Idioma: Português Ano de publicação: 2009 Tipo de documento: Tese
Texto completo: Disponível Coleções: Bases de dados internacionais Base de dados: BBO - Odontologia / LILACS Assunto principal: Saliva / Fenda Labial / Fissura Palatina / Análise de Sequência de DNA / Fatores Reguladores de Interferon / Anodontia Tipo de estudo: Estudo diagnóstico / Estudo de rastreamento Limite: Humanos Idioma: Português Ano de publicação: 2009 Tipo de documento: Tese
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