Potencial de transdiferenciação neural das células-tronco mesenquimais da medula óssea de equino / Potential of neural transdifferentiation of mesenchymal stem cells from equine bone marrow

RESUMO

Os primeiros estudos demonstrando o potencial de trandiferenciação neural das células-tronco mesenquimais (CTMs) provenientes da medula óssea (MO) foram conduzidos em camundogos e humanos no início da década de 2000. Após esse período, o número de pesquisas e publicações com o mesmo propósito tem aumentado, mas com raros ou escassos estudos na espécie equina. Nesse sentindo, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial in vitro da transdiferenciação neural das CTMs provenientes da MO de equinos utilizando-se dois protocolos P1 (forksolin e ácido retinóico) e P2 (2-βmecarptoetanol). Após a confirmação das linhagens mesenquimais, pela positividade para o marcador CD90 (X=97,94%), negatividade para o marcador CD34 e resposta positiva a diferenciação osteogênica, as CTMs foram submetidas a transdiferenciação neural (P1 e P2) para avaliação morfológica e expressão dos marcadores neurais GFAP e β3 tubulina por citometria de fluxo. Os resultados revelaram mudanças morfológicas em graus variados entre os protocolos testados. No protocolo 1, vinte quatro horas após a incubação com o meio de diferenciação neural, grande proporção de células (>80%) apresentaram morfologia semelhante a células neurais, caracterizadas por retração do corpo celular e grande número de projeções protoplasmáticas (filopodia). Por outro lado, de forma comparativa, já nos primeiros 30 minutos após a exposição ao antioxidante β-mercaptoetanol (P2) as CTMs apresentaram rápida mudança morfológica caracterizada principalmente por retração do corpo celular e menor número de projeções protoplasmáticas. Também ficou evidenciado com o uso deste protocolo, menor aderência das células após tempo de exposição ao meio de diferenciação, quando comparado ao P1. Com relação a análise imunofenotípica foi observado uma maior (P<0,001) expressão dos marcadores GFAP e β3 tubulina ao término do P2 quando comparado ao P1. A habilidade das CTMs em gerar tipos celulares relacionados a linhagem neural é complexa e multifatorial, dependendo não só dos agentes indutores, mas também do ambiente no qual estas células são cultivadas. Desta forma um maior número de estudos é necessário para o melhor entendimento do processo de transdiferenciação neural a partir de CTMs de equinos.

ABSTRACT

The first studies showing the potential of neural transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow (BM) were conducted in camundogos and humans in the early 2000s. After this period, the number of research and publications with the same purpose increased, but with rare or scarce studies in horses. The aim of this study was to evaluate in vitro neuronal transdifferentiation potential of MSCs from equine BM using two protocols P1 (forksolin and retinoic acid) and P2 (2-βmecarptoetanol). After confirming the mesenchymal lineages, by positivity for the marker CD90 (X=97.94%), negative for the marker CD34 and positive response for osteogenic differentiation, MSCs were subjected to neural transdifferentiation (P1 and P2) for morphological analysis and expression of neural markers GFAP and β3 tubulin by flow cytometry. The results revealed morphological changes in varying degrees between the tested protocols. In protocol 1, twenty four hours after incubation with the media of neural differentiation, a large proportion of cells (>80%) had similar morphology to neural cells, characterized by retraction of cellular body and a large number of cytoplasmic extension (filopodia). However, comparatively, within the first 30 minutes after exposure to the antioxidant β-mercaptoethanol (P2) MSCs showed rapid morphological changes characterized mainly by retraction of cellular body and less cytoplasmic extension. It was also evidenced with the use of this protocol, lower cellular adhesion after exposure to media when compared to P1. Regarding the immunophenotyping analysis it was observed a higher (P<0.001) expression of the markers GFAP and β3 tubulin at the end of P2 compared to P1. The ability of MSCs to generate cell types related to neural lineage is complex and multifactorial, depending not only of inducing agents, but also the environment in which these cells will be cultivated. Thus a greater number of studies are necessary to better understand the process of neural transdifferentiation of MSCs from equine.