Padronização e validação de método de RT-PCR em tempo real para o vírus de febre amarela e cinética de replicação viral in vitro / Standardization and validation of RT-PCR in real time to the Yellow Fever virus and kinetics of viral replication in vitro

RESUMO

O desenvolvimento e a produção de vacinas virais, de uma forma geral, envolvem diversas etapas que necessitam do monitoramento da carga viral ao longo de todo processo. Essas etapas vão desde a produção do antígeno, purificação, inativação, liofilização, testes pré-clínicos e clínicos e uma vez o produto licenciado, um processo de farmacovigilância contínuo se faz necessário. Atualmente em Biomanguinhos essas etapas são monitoradas pelo ensaio de titulação em placa de lise que leva em torno de sete a dez dias. Com o recente desenvolvimento do qRT-PCR em tempo real (qRT-PCR), temos disponível uma abordagem mais rápida para este monitoramento, que pode ser feito em poucas horas. Dentro deste contexto, desenvolver, padronizar e validar uma técnica que permita quantificar o vírus da febre amarela de forma rápida e eficaz em todas as etapas acima descritas é de extrema importância na otimização deste processo. Para tal foi construída uma curva padrão plasmidial e parâmetros como linearidade, precisão intermediária e especificidade foram avaliados. Além disso, foi definido o limite de detecção e quantificação do teste. Para garantir a qualidade do teste foram estabelecidos controles exógenos e endógenos, a fim de evitar resultados falso negativos. A análise estatística dos dados de quantificação viral, nos revelam uma excelente correlação entre os resultados obtidos em cópias de RNA/mL quantificados por qRT-PCR e o título viral calculados em ensaios de plaque (R = 0.96), além da obteção de um fator de correlação, para conversão dos valores de PCR em tempo real para plaque. A análise dos resultados demonstrou que os experimentos da validação atendem a todos os parâmetros definidos pelo setor de qualidade. Esta técnica se mostrou eficiente para determinação da carga viral do vírus da febre amarela tanto em amostra in vivo quanto in vitro, tornando-se assim uma ferramenta muito importante em todos os projetos desenvolvidos no LATEV e podendo inclusive, no futuro ser adotada como padrão ouro nas análises laboratoriais e de controle de qualidade dos lotes vacinais.