Ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante por ExoU de Pseudomonas aeruginosa / Activation of oxidative stress and antioxidant response by ExoU of Pseudomonas aeruginosa

RESUMO

ExoU, uma citotoxina produzida pelo patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa e translocada para o citosol de células hospedeiras via sistema de secreção do tipo III, é associada à gravidade de infecções agudas. No presente trabalho, o efeito de ExoU na ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante foi avaliado em culturas de células epiteliais respiratórias humanas infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de ExoU), com a mutante deletada no gene exoU, PA103∆exoU, ou com a mutante complementada com exoU sem atividade tipo fosfolipase A2, PA103∆UT/S142A. Análises das dosagens de hidroperóxidos lipídicos e isoprostanos, considerados marcadores de estresse oxidativo, revelaram que ExoU promoveu um aumento em suas concentrações. Foi observado, também, que ExoU estimulou a produção de espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e peroxinitrito nas células infectadas, assim como a expressão de iNOS e eNOS, mas não de nNOS. Além disso, ExoU foi responsável pelo aumento da atividade de SOD1 e pela redução dos níveis de GSH, mas não afetou a atividade da catalase ou de NQO1. No modelo in vivo, a dosagem de malondialdeído, um subproduto da lipoperoxidação de membranas, evidenciou uma maior produção deste composto no pulmão de camundongos infectados pela cepa produtora de ExoU, em comparação ao pulmão de camundongos infectados pela cepa mutante. Em conjunto, estes resultados mostram que ExoU ativa a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, levando à peroxidação lipídica e modulando o sistema de defesa antioxidante...

ABSTRACT

ExoU, a cytotoxin produced by the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa and translocated into the cytosol of host cells via a type III secretion system, is associated with severity of acute infections. In the present work, the effect of ExoU in the activation of oxidative stress and antioxidant response was evaluated in cultures of human respiratory epithelial cells infected with P. aeruginosa PA103 strain (producer of ExoU), or with its isogenic mutants, the ExoU-deficient PA103∆exoU or the exoU-depleted mutant complemented with an exoU gene with a site-specific mutation in the PLA2 catalytic site, PA103∆UT/S142A. Analysis of dosages of lipid hydroperoxides and isoprostanes, considered markers of oxidative stress, revealed that ExoU promoted an increase in their concentrations. It was also observed that ExoU stimulated the production of reactive oxygen species, nitric oxide and peroxynitrite in infected cells, as well as the expression of iNOS and eNOS, but not nNOS. Furthermore, ExoU was responsible for the increased activity of SOD1 and the reduced levels of GSH, but did not affect the activity of catalase or NQO1. In the in vivo model, the analysis of malondialdehyde, a byproduct of lipid peroxidation of membranes, showed increased production of this compound in the lungs of mice infected with the ExoU-producing strain compared to the lungs of mice infected with the mutant strain. Together, these results show that ExoU activates the production of reactive oxygen and nitrogen species, leading to lipid peroxidation and modulating the antioxidant defense system...