Efeito do ácido protocatecuico sobre o desenvolvimento in vitro de folículos secundários ovinos isolados

RESUMO

O ácido protocatecuico (PCA) é um composto fenólico que tem sido bastante estudado devido ao seu potencial antioxidante in vivo e in vitro. Entretanto, ainda não é conhecido o seu efeito antioxidante no cultivo in vitro de folículos secundários ovinos isolados. Sendo assim, o presente estudo avaliou o efeito do ácido protocatecuico (PCA), como único antioxidante no meio de cultivo, sobre a morfologia, o desenvolvimento, os níveis de GSH e mitocôndrias ativas, retomada da meiose e fragmentação de DNA de folículos secundários ovinos isolados cultivados in vitro. Folículos secundários (200-230 m) foram isolados e cultivados durante 12 dias em meio controle constituído pelo Meio Essencial Mínimo (-MEM) suplementado com BSA, insulina, glutamina e hipoxantina (-MEM; meio sem antioxidantes) ou adicionado de transferrina, selênio e ácido ascórbico (-MEM+ com antioxidantes) ou de diferentes concentrações de PCA (56,25; 112,5; 225; 450; 900 g/mL). A cada 6 dias, os folículos foram avaliados quanto aos aspectos morfológicos (folículos normais, formação de antro e diâmetro folicular). Ao final do cultivo, os oócitos foram recuperados para a determinação da percentagem de oócitos completamente crescidos (oócitos 110 m) e os níveis intracelulares de glutationa (GSH) e mitocôndrias ativas. Além disso, após o cultivo, os oócitos foram maturados e a configuração da cromatina e a fragmentação do DNA foram avaliados. Os dados de sobrevivência folicular, formação de antro, oócitos 110 m, retomada da meiose e fragmentação do DNA foram comparados pelo teste do Qui-quadrado; o diâmetro folicular, a taxa de crescimento, os níveis de GSH e a atividade mitocondrial foram submetidos ao teste de Agostinho-Pearson (análogo do teste Shapiro-Wilk) e Shapiro-Wilk, respectivamente, e comparados pelo teste Kruskal-Wallis (P<0,05). Após 12 de cultivo, o meio contendo 56,25 g/mL de PCA apresentou sobrevivência folicular superior ao meio controle e demais tratamentos (P<0,05), exceto ao 900 g/mL de PCA (P>0,05). A formação de antro foi significativamente superior nos tratamentos contendo 56,25; 112,5 ou 900 g/mL de PCA, comparado ao -MEM, e similar (P>0,05) aos demais tratamentos. Em relação à extrusão, diâmetro folicular e taxa de crescimento diário, não houve diferença significativa (P> 0,05) entre os tratamentos. A taxa de oócitos completamente crescidos foi semelhante (P>0,05) entre os tratamentos contendo PCA e o -MEM+, e superior (P<0,05) ao -MEM, exceto o meio contendo 450 g/mL de PCA (P>0,05). Os níveis de GSH e a atividade mitocondrial oocitária foram superiores (P<0,05) em -MEM+ quando comprado ao -MEM, e similares (P>0,05) aos demais tratamentos. As taxas de retomada da meiose e fragmentação do DNA foram similar (P>0,05) entre -MEM+ e 56,25 g/mL de PCA. Conclui-se que o PCA (56,25 g/mL), como único antioxidante adicionado ao meio para cultivo de folículos secundários ovinos isolados, substituindo a associação de transferrina, selênio e ácido ascórbico, mantém a sobrevivência folicular, os níveis de GSH e mitocôndrias ativas, a capacidade de retomada da meiose e a integridade do DNA de oócitos cultivados.

ABSTRACT

Protocatecuic acid (PCA) is a phenolic compound that has been extensively studied due to its antioxidant potential in vivo and in vitro. However, its antioxidant effect in the in vitro culture of ovine isolated secondary follicles is not yet known. Thus, the present study evaluated the effect of protocatechuic acid (PCA), as the sole antioxidant in the culture medium, on the morphology, development, levels of GSH and active mitochondria, resumption meiosis and DNA fragmentation of ovine isolated secondary follicles cultured in vitro. At each 6 days, morphological aspects were analyzed (normal follicles, antrum formation and follicular diameter). At the end of culture, the percentage of fully-grown oocytes (oocytes 110 m) was evaluated. The secondary follicles (200-230 m) were isolated and cultured for 12 days in -Minimal Essential Medium (-MEM) supplemented with BSA, insulin, glutamine and hypoxanthine (-MEM antioxidant free-medium) or added by transferrin, selenium and ascorbic acid (-MEM+; with antioxidant) or different concentrations of PCA (56.25; 112.5; 225; 450; 900 g/mL). The parameters analyzed were morphology, antrum formation, extrusion rate, follicular diameter, growth, fully grown oocytes (oocytes 110 m) rates, GSH intracellular levels and metabolically active mitochondria. Moreover, after culture, oocytes were matured and the chromatin configuration and DNA fragmentation were evaluated. The rates of normal follicles, antrum formation, oocytes 110 m, DNA fragmentation and meiotic resumption were compared by Qui-square test. Follicular diameter, growth rate and levels of GSH and mitochondrial activity were submitted to the Agostinho-Pearson test (analog of the Shapiro-Wilk test) and Shapiro-Wilk, respectively, and compared by the Kruskal-Wallis test (P <0.05). After 12 days, the treatment containing 56.25 g/mL PCA showed higher percentage of normal follicles than control medium and to the other treatments (P<0.05), except for 900 g/mL PCA (P>0.05). The antrum formation was significantly higher in treatments containing 56.25; 112.5 or 900 g/mL PCA, compared to the -MEM and similar (P>0.05) to the other treatments. The rates of fully grown oocytes (110 m) were similar (P>0.05) among all treatments containing PCA and -MEM+, and those were superior (P<0.05) to -MEM, except for 450 g/mL PCA (P>0.05). The oocyte levels of GSH and mitochondrial activity were higher (P<0.05) in -MEM+ compared to the -MEM and similar (P>0.05) to all PCA treatments. The rates of meiotic resumption and DNA fragmentation were similar (P>0.05) between -MEM+ and 56.25 g/mL PCA. In conclusion, PCA at 56.25 g/mL as the sole antioxidant added to the medium for ovine isolated secondary follicle culture, replacing the association of transferrin, selenium and ascorbic acid, maintains follicular survival, GSH and active mitochondria levels, meiotic developmental competence and DNA integrity of cultured oocytes.