RESUMO
A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa ocasionada pela translocação recíproca entre o oncogene ABL 1, localizado no cromossomo 9, com o gene BCR, localizado no cromossomo 22 [t9,22], originando um novo cromossomo, denominado Philadelphia. A proteína quimérica da translocação BCR-ABL possui atividade tirosino-quinase aumentada e anormal. Apesar da contribuição indubitável da proteína BCR-ABL, alguns estudos já evidenciaram que as células-tronco leucêmicas podem ser independente de BCR-ABL para sobreviver, indicando que alguns fatores presentes no microambiente tumoral, como as microvesículas e exossomos, podem sustentar as células-tronco leucêmicas (LSCs). Os exossomos, também denominados de nanovesículas, possuem de 40 a 100nm de diâmetro, são responsáveis pela comunicação intercelular e tem ganhado atenção nos últimos anos, devido a grande quantidade de moléculas e substâncias que podem transportar de uma célula a outra, ativando importantes vias de sinalização. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi purificar os exossomos do plasma de medula óssea de pacientes com LMC em fase crônica da doença ao diagnóstico, caracterizar o perfil imunofenotípico, realizar uma análise proteômica Label Free para identificar o perfil proteômico e identificar os RNAs longos não codificantes (lncRNAs) presente no interior destes exossomos. Foram identificadas 341 proteínas diferencialmente expressas entre pacientes com LMC e doadores, e a proteína BOC, receptor da via de Hedgehog (Hh), estava aumentada na amostra dos pacientes. O perfil imunofenotípico revelou que os exossomos foram purificados com sucesso e que, provavelmente, estavam sendo secretados pelas células mesenquimais, megacariócitos e granulócitos no microambiente da medula, uma vez que houve aumento da diferencça de média de intensidade de fluorescência (dMIF) para as tetraspaninas consideradas marcadoras destas populações celulares, respectivamente (CD105, CD61 e CD65). Em relação ao lncRNAs, ANTINOS2A, RoR, SFMBT2 e VLDLR apresentaram reprodutibilidade dos dados em amostras dos doadores, estando ausentes nos pacientes. Neste grupo somente o lncRNA HOTAIR apresentou-se diferencialmente expresso com um fold-change de 13,24. Nossos dados permitem inferir que os exossomos presentes no plasma de pacientes com LMC são capazes de carrear conteúdo molecular, de ativar a via de Hh e, assim, favorecer a leucemogênese no início da LMC.
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Leucemia Mielogênica Crônica BCR-ABL Positiva/genética , Proteômica , Exossomos , Transdução de Sinais , RNA Longo não CodificanteRESUMO
Chronic atrophic gastritis (CAG) is a very common gastritis and one of the major precursor lesions of gastric cancer, one of the most common cancers worldwide. The molecular mechanism underlying CAG is unclear, but its elucidation is essential for the prevention and early detection of gastric cancer and appropriate intervention. A combination of two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry was used in the present study to analyze the differentially expressed proteins. Samples from 21 patients (9 females and 12 males; mean age: 61.8 years) were used. We identified 18 differentially expressed proteins in CAG compared with matched normal mucosa. Eight proteins were up-regulated and 10 down-regulated in CAG when compared with the same amounts of proteins in individually matched normal gastric mucosa. Two novel proteins, proteasome activator subunit 1 (PSME1), which was down-regulated in CAG, and ribosomal protein S12 (RPS12), which was up-regulated in CAG, were further investigated. Their expression was validated by Western blot and RT-PCR in 15 CAG samples matched with normal mucosa. The expression level of RPS12 was significantly higher in CAG than in matched normal gastric mucosa (P < 0.05). In contrast, the expression level of PSME1 in CAG was significantly lower than in matched normal gastric mucosa (P < 0.05). This study clearly demonstrated that there are some changes in protein expression between CAG and normal mucosa. In these changes, down-regulation of PSME1 and up-regulation of RPS12 could be involved in the development of CAG. Thus, the differentially expressed proteins might play important roles in CAG as functional molecules.
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Feminino , Humanos , Masculino , Pessoa de Meia-Idade , Mucosa Gástrica/química , Gastrite Atrófica/metabolismo , Proteínas Musculares/genética , Proteômica , Complexo de Endopeptidases do Proteassoma/genética , Proteínas Ribossômicas/metabolismo , Western Blotting , Doença Crônica , Regulação para Baixo , Eletroforese em Gel Bidimensional , Mucosa Gástrica/patologia , Gastrite Atrófica/genética , Helicobacter pylori , Espectrometria de Massas , Proteínas Musculares/metabolismo , Complexo de Endopeptidases do Proteassoma/metabolismo , Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase Reversa , Proteínas Ribossômicas/genética , Regulação para CimaRESUMO
PURPOSE: Interstitial cystitis/painful bladder syndrome (IC/PBS) is characterized by chronic pain, pressure and discomfort felt in the pelvis or bladder. An in-depth shotgun proteomics study was carried out to profile the urinary proteome of women with IC/PBS to identify possible specific proteins and networks associated with IC/PBS. MATERIALS AND METHODS: Urine samples from ten female IC/PBS patients and ten female asymptomatic, healthy control subjects were analyzed in quadruplicate by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) on a hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer. Gas-phase fractionation (GPF) was used to enhance protein identification. Differences in protein quantity were determined by peptide spectral counting. RESULTS: a-1B-glycoprotein (A1BG) and orosomucoid-1 (ORM1) were detected in all IC/PBS patients, and = 60 percent of these patients had elevated expression of these two proteins compared to control subjects. Transthyretin (TTR) and hemopexin (HPX) were detected in all control individuals, but = 60 percent of the IC/PBS patients had decreased expression levels of these two proteins. Enrichment functional analysis showed cell adhesion and response to stimuli were down-regulated whereas response to inflammation, wounding, and tissue degradation were up-regulated in IC/PBS. Activation of neurophysiological processes in synaptic inhibition, and lack of DNA damage repair may also be key components of IC/PBS. CONCLUSION: There are qualitative and quantitative differences between the urinary proteomes of women with and without IC/PBS. We identified a number of proteins as well as pathways/networks that might contribute to the pathology of IC/PBS or result from perturbations induced by this condition.
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Feminino , Humanos , Biomarcadores/urina , Cistite Intersticial/etiologia , Proteínas/análise , Proteômica/métodos , Urina/química , Doença Crônica , Cistite Intersticial/patologia , Projetos PilotoRESUMO
A patogênese da Cardiomiopatia Chagásica Crônica (CCC) ainda é assunto de intenso debate. A CCC apresenta intenso infiltrado inflamatório no tecido cardíaco, onde os linfócitos T infiltrantes produzem citocinas inflamatórias, como IFN-gama e TNF-alfa. Adicionalmente, pacientes com CCC apresentam um pior prognóstico quando comparados aos portadores de outras cardiomiopatias de etiologia não inflamatória, como a cardiomiopatia dilatada idiopática (CDI) e a cardiomiopatia isquêmica (CI), sugerindo que mecanismos inflamatórios participam da patogênese e evolução da doença. Além disso, evidências anteriores de nosso grupo indicaram alterações do metabolismo energético na CCC. Neste trabalho, comparamos a expressão protéicado miocárdio de pacientes com CCC, CDI e CI e indivíduos sem cardiomiopatias, com foco em proteínas relacionadas ao metabolismo energético celular. Para a identificação do perfil de expressão protéica no miocárdio de pacientes com CCC, utilizamos a técnica de separação por eletroforese bidimensional, e a identificação das proteínas foi feita por espectrometria de massa. A maioria dos spots identificados corresponde a proteínas estruturais ou proteínas do metabolismo, principalmente do metabolismo energético. Foram identificadas também proteínas envolvidas na apoptose, em processos imunes e de resposta ao estresse. A análise da expressão protéica diferencial, utilizando marcação fluorescente, nos permitiu analisar o padrão de expressão das proteínas diferencialmente expressas no miocárdio de pacientes com CCC, CDI e CI e de indivíduos sem cardiomiopatias, dentro de um total de 683 spots e 230 proteínas distintas identificadas. Observamos que o padrão de expressão protéica do miocárdio de pacientes com CCC é o mais distinto em relação ao padrão de expressão protéica presente no miocárdio de indivíduos sem cardiomiopatias; e que o padrão de expressão das proteínas presentes no miocárdio de pacientes com CI é o que mais se assemelha ao padrão...
The pathogenesis of Chagas disease cardiomyopathy (CCC) is still controversial. CCC is characterized by an intense cardiac inflammatory infiltrate; infiltrating T lymphocytes produce inflammatory cytokines such as IFN-gamma and TNF-alpha. Patients afflicted by CCC display a worse prognosis when compared to patients afflicted by non-inflammatory cardiomyopathies such as idiopathic dilated cardiomyopathy (IDC) and ischemic cardiomyopathy (IC), suggesting that inflammatory mechanisms play a role in the pathogenesis and progression of the disease. In addition, previous evidence from our group suggested the presence of energy metabolism changes in CCC. In the present work, we compared the protein expression profile of the myocardium of patients with CCC, IDC, IC, and noncardiomyopathic subjects, with focus on energetic metabolism-related proteins. We used bidimensional electrophoresis to analyze the protein expression profile in the myocardium of patients afflicted by CCC, and proteins were identified by mass spectrometry. The majority of spots were identified as structural proteins or metabolism proteins, especially of energy metabolism. We were also able to identify apoptosis-, immune system- and stress response-related proteins. Using fluorescent labeling, we analyzed the differential expression profile in the myocardium of CCC, IDC and IC patients, from a total of 683 spots and 230 distinct proteins identified. We observed that the protein expression profile of CCC patients is the most distinct when compared to non-cardiomyopathic subjects. On the other hand, the protein expression profile of IC patients is similar, at some extent, to the expression profile of non-cardiomyopathic patients. We also found altered expression of proteins related to apoptosis (e.g. cathepsin D and Akt2), oxidative stress (e.g. catalase), endoplasmic reticulum stress (e.g. disulfilte isomerase protein), cardiac remodeling (e.g. gelsolin) among CCC, IDC and IC patients...
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Cardiomiopatia Dilatada , Cardiomiopatia Chagásica , Metabolismo Energético , Insuficiência Cardíaca , Miocardite , ProteômicaRESUMO
Estudos recentes mostraram que TGF-Beta está envolvido na cardiopatia chagásica aguda e crônica. O aumento de seus níveis plasmáticos e a ativação da sua via de sinalização celular são aspectos peculiares da doença chagásica crônica. Além do seu relevante papel na patologia chagásica, também se observou que esta citocina está intimamente associada ao T. cruzi como um regulador de diferentes etapas de seu ciclo de vida. Trabalhos anteriores demonstraram que T. cruzi é capaz de ativar TGF-Beta latente, utilizando-o na invasão às células hospedeiras e que amastigotas de T. cruzi se ligam e internalizam TGF-Beta recombinante, estando este evento relacionado à capacidade de proliferação de amastigotas e sua diferenciação em tripomastigotas no final do ciclo intracelular. Este conjunto de informações nos levou ao questionamento de quais moléculas de T. cruzi poderiam estar envolvidas nos processos de proliferação e diferenciação celular frente ao estímulo por TGF-Beta. Neste sentido, o presente projeto tem por principal objetivo a caracterização de moléculas responsivas ao estímulo de TGF-Beta através de uma abordagem fosfoproteômica. Para tal, extratos de proteínas totais de epimastigotas de T. cruzi (cepa Y), incubadas ou não com TGF-Beta, foram preparados durante a fase exponencial de crescimento do parasito. Evidenciamos que a dose ótima de TGF-Beta para maior indução de fosforilação seria de 5 ng/ml. Em seguida, o tempo ótimo de indução com TGF-Beta (1, 5, 15, 30 e 60 minutos) foi testado e concluímos que as diferenças entre os padrões de fosforilação são muitos sutis em géis unidimensionais, nos fazendo optar pela análise exclusiva dos perfis em géis bidimensionais de 7 cm com faixa de pH 3-10 não-linear. A avaliação dos perfis bidimensionais demonstrou diferenças nos padrões de fosforilação entre os tempos estudados, nos levando a manter um estudo de cinética de tempo. As imagens dos géis foram analisadas e algumas das proteínas consideradas responsivas a TGF-Beta foram identificadas por espectrometria de massas. Observamos que as proteínas de choque térmico, tubulinas, desidrogenases, enolases, ciclofilina A, GrpE, cruzipaína, fator de elongamento 1-alfa, fator de iniciação eucariótica 5a, entre outras, têm sua fosforilação e/ou expressão moduladas em resposta a TGF-Beta. Buscamos correlacionar a função já descrita na literatura para cada proteína com seu possível papel na sinalização intracelular disparada por TGF-Beta, em concordância com o comportamento de fosforilação e/ou expressão apresentado em nossas análises. Por último, foi avaliado se a adição de TGF-beta a culturas de epimastigotas teria algum efeito sobre a proliferação dos parasitos. Verificamos que a adição de TGF-Beta promoveu um aumento de até 73% no crescimento dos parasitos nas primeiras 24 horas de estudo. O conjunto de dados obtidos contribui para a elucidação dos mecanismos moleculares relacionados à sinalização de TGF-Beta, proporcionando uma fonte para detecção de novos alvos terapêuticos para a doença de Chagas.
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Doença de Chagas , Fosforilação , Proteômica , Fator de Crescimento Transformador beta , Trypanosoma cruziRESUMO
Chronic Chagas' disease cardiomyopathy (CCC) is an often fatal outcome of Trypanosoma cruzi infection, with a poorer prognosis than other cardiomyopathies. CCC is refractory to heart failure treatments, and is the major indication of heart transplantation in Latin America. A diffuse myocarditis, plus intense myocardial hypertrophy, damage and fibrosis, in the presence of very few T. cruzi forms, are the histopathological hallmarks of CCC. To gain a better understanding of the pathophysiology of CCC, we analyzed the protein profile in the affected CCC myocardium. Homogenates from left ventricular myocardial samples of end-stage CCC hearts explanted during heart transplantation were subjected to two-dimensional electrophoresis with Coomassie blue staining; protein identification was performed by MALDI-ToF mass spectrometry and peptide mass fingerprinting. The identification of selected proteins was confirmed by immunoblotting. We demonstrated that 246 proteins matched in gels from two CCC patients. They corresponded to 112 distinct proteins. Along with structural/contractile and metabolism proteins, we also identified proteins involved in apoptosis (caspase 8, caspase 2), immune system (T cell receptor ß chain, granzyme A, HLA class I) and stress processes (heat shock proteins, superoxide dismutases, and other oxidative stress proteins). Proteins involved in cell signaling and transcriptional factors were also identified. The identification of caspases and oxidative stress proteins suggests the occurrence of active apoptosis and significant oxidative stress in CCC myocardium. These results generated an inventory of myocardial proteins in CCC that should contribute to the generation of hypothesis-driven experiments designed on the basis of the classes of proteins identified here.