Estudo da espermatogênese e maturação espermática em cães senis

Estudos mais aprofundados dos processos de espermatogênese e maturação epididimária durante a senescência na espécie canina são necessários, permitindo elucidar as características patológicas do ejaculado de cães em idade senil. O presente estudo tem como objetivo comparar entre cães jovens e senis as características vasculares, hemodinâmicas, biométricas e ecogênicas do parênquima testicular e epididimário; a expressão dos receptores de LH, estrógeno e andrógeno no testículo e nos três segmentos epididimários; a morfo-funcionalidade dos espermatozoides provenientes dos três segmentos epididimários e as diferenças histo-morfológicas do parênquima testicular e epididimário. Foram selecionados dez cães jovens em maturidade reprodutiva (1 a 4 anos) e oito cães senis (acima de 7 anos), de diferentes raças, pesando entre 10 e 40 kg, constituindo dois grupos experimentais: Grupo Jovem e Grupo Senil. Os animais foram avaliados por ultrassonografia escrotal bidimensional, Doppler espectral da artéria testicular e Doppler colorido dos testículos e epidídimos. Após orquiectomia, a expressão dos receptores de andrógeno, LH e estrógeno foi avaliada no parênquima testicular e epididimário por meio das técnicas de RT-PCR e imunohistoquímica. Ainda, espermatozoides foram colhidos dos três segmentos epididimários (cabeça, corpo e cauda) e avaliados quanto a motilidade, concentração, morfologia, integridade de membranas acrossomal e plasmática, função mitocondrial e condensação da cromatina espermática. Para análise estatística, foi realizado teste T de Student ou Wilcoxon para comparação entre os grupos e os dados de RT-PCR foram analisados pelo procedimento MIXED, considerando-se P<0,05 para diferenças significativas. O grupo Jovem apresentou maior velocidade de fluxo sanguíneo e menor índice de pulsatilidade na artéria testicular, bem como maior vascularização do parênquima testicular em relação ao Grupo Senil. Os animais senis apresentaram padrão de expressão testicular e epididimário dos receptores de andrógeno, LH e estrógeno alfa distinto dos cães jovens. Não foi constatada a expressão do receptor de estrógeno beta nos testículos e epidídimos de cães. Cães senis apresentaram alterações de concentração espermática, porcentagem de defeitos espermáticos, padrão de motilidade, lesão de membranas plasmática e acrossomal, potencial e atividade mitocondrial e condensação de cromatina dos espermatozoides. Como conclusão, a senescência na espécie canina altera a hemodinâmica da artéria testicular e vascularização dos testículos, sem modificar a biometria e ecogenicidade testicular e epididimária. Ademais, há modificação na expressão diferencial dos receptores hormonais (andrógeno, estrógeno alfa e LH), influenciando o ambiente testicular e epididimário e, por consequência, prejudicando a espermatogênese e maturação espermática no trajeto epididimário, culminando em alterações morfo-funcionais dos espermatozoides em cães.

The study on the spermatogenesis and epididymal maturation in the canine species during senescence is necessary to further elucidate the pathological sperm features of aged dogs. The present study aims to compare between young and senile dogs the vascular, hemodynamic, biometric and echogenic features of testicular and epididymal parenchyma; the tissue expression of LH, estrogen and androgen receptors in the testis and epididymal caput, corpus and cauda; the morpho-functionality of epididymal sperm and the histo-morphological differences of testis and epididymides parenchyma. Ten young dogs within reproductive age (1 to 4 years) and eight senile dogs (over 7 years), of different breeds, weighing between 10 and 40 kg, were selected and assigned to two experimental groups: Young Group and Senile Group. Dogs were evaluated through B-mode scrotal ultrasound, testicular artery spectral Doppler and color Doppler of the testis and epididymides. After orchiectomy, the expression of androgen, LH and estrogen receptors were evaluated in testis and epididymis parenchyma through RT-PCR and immunohistochemistry. Moreover, sperm were harvested from the caput, corpus and cauda epididymides and evaluated for motility, concentration, morphology, integrity of acrosomal and plasma membranes, mitochondrial functioning and chromatin condensation. For statistical analysis, Student's T test or Wilcoxon was performed to compare between the groups and the RT-PCR data were analyzed using proc MIXED, considering P<0.05 as significant different. The Young group showed higher testicular artery blood flow speed and lower pulsatility index, as well as higher testicular vascularization compared to the Senile Group. Senile dogs had different testicular and epididymal expression pattern of androgen, LH and alpha estrogen receptors compared to young dogs. We were not able to detect the expression of beta estrogen receptor in canine testis and epididymis. Senile dogs had significant changes in epididymal sperm concentration, percentage of sperm defects, motility pattern, damage to plasma and acrosomal membranes, mitochondrial potential and activity and sperm chromatin condensation. In conclusion, senescence alters testicular artery blood flow and vascularization of the testis, without modifying testicular and epididymal biometry and echodensity. In addition, hormonal receptors (androgen, alpha estrogen and LH) were differentially expressed in aged dogs, influencing testicular and epididymal environment and, consequently, compromising spermatogenesis and sperm maturation throughout epididymides, leading to morpho-functional changes in canine sperm.

Efeito da senescência reprodutiva sobre aspectos morfológicos, funcionais e de estresse oxidativo do sêmen fresco e criopreservado de cães

O presente estudo teve como objetivos comparar o sêmen de cães jovens e senis, por avaliação morfo-funcional, estresse oxidativo e quantificação de produtos avançados de glicação (AGEs); comparar a congelabilidade seminal de cães jovens e senis e verificar a ação dos produtos avançados de glicação, oxidação proteica e estresse oxidativo na criopreservação seminal de cães senis. Foram selecionados 22 cães, alocados em dois grupos experimentais de acordo com a idade: Grupo Jovem (n=11) e Grupo Senil (n=11). Os grupos foram adicionalmente subdivididos em Grupo Sêmen Fresco e Grupo Sêmen Criopreservado. A divisão etária foi realizada de acordo com o porte dos animais, sendo porte pequeno considerado senil a partir de 8 anos de idade, porte médio a partir de 7 anos de idade e porte grande acima de 6 anos de idade. Independentemente do porte, os cães jovens em idade reprodutiva foram considerados entre 1 e 5 anos de idade. O Grupo Fresco foi submetido a avaliações seminais imediatas, incluindo volume, cor, aspecto do ejaculado, concentração espermática e análise computadorizada da motilidade (CASA). Logo após, foram realizadas avaliações morfo-funcionais, incluindo atividade mitocondrial dos espermatozoides, estresse oxidativo lipídico, estresse oxidativo proteico, dosagem de produtos avançados de glicação e dosagem de concentração proteica, citometria de fluxo utilizando as sondas fluorescentes para a avaliação espermática da integridade de membrana plasmática e acrossomal e de potencial de membrana mitocondrial e análise de fragmentação de DNA. O Grupo Congelado foi submetido ao protocolo de congelação em uma etapa e após, no mínimo uma semana, as amostras foram descongeladas a 37ºC por 30 segundos e, então, avaliadas quanto à concentração espermática, análise computadorizada da motilidade (CASA) e as mesmas avaliações morfo-funcionais realizadas para o Grupo Jovem. Como resultados, os machos do Grupo Jovem apresentaram maior escore de libido, parâmetros da motilidade espermática, alta atividade mitocondrial dos espermatozoides e menores valores de atividade mitocondrial média, defeitos espermáticos totais, defeitos espermáticos maiores e gota citoplasmática proximal. No sêmen fresco, o Grupo Jovem obteve maiores valores de integridade da membrana acrossomal dos espermatozoides e baixo potencial de membrana mitocondrial, assim como menores valores de integridade da membrana plasmática e acrossomal e alto potencial de membrana mitocondrial. No sêmen descongelado, o Grupo Jovem apresentou maiores valores de integridade de membrana acrossomal dos espermatozoides. No sêmen de cães jovens, o Sub-grupo Fresco obteve maiores valores de integridade de membrana acrossomal e integridade de membrana acrossomal com lesão de membrana plasmática. No sêmen de cães senis, o Sub-grupo Fresco apresentou maiores valores de integridade de membrana acrossomal, integridade de membrana plasmática e acrossomal e alto potencial de membrana mitocondrial, assim como menor porcentagem de espermatozoides com baixo potencial de membrana mitocondrial. Na comparação entre os sub-grupos, houve maiores valores para parâmetros da motilidade espermática, integridade de membrana plasmática com lesão de acrossomo, médio potencial de membrana mitocondrial, integridade de membrana plasmática, alta atividade mitocondrial e estresse oxidativo no Sub-grupo Descongelado, além de maiores valores de amplitude de deslocamento lateral da cabeça, espermatozoides estáticos, lesão de membrana acrossomal e plasmática, média atividade mitocondrial e concentração de proteínas no pellet de espermatozoides. A partir de tais resultados, é possível concluir que o sêmen de cães senis apresenta qualidade inferior ao de cães jovens, bem como reduzida congelabilidade. Nos cães senis, possivelmente, a falha na eliminação da gota citoplasmática dos espermatozoides promova disfunções mitocondriais, culminando na alteração da motilidade espermática. Por fim, as avaliações de parâmetros oxidativos não se mostram acuradas para a avaliação do impacto da senescência reprodutiva.

This study aimed to compare the semen of young and senile dogs, through the evaluation of morphological and functional attributes, oxidative stress and quantification of advanced glycation ending products (AGEs); compare the seminal freezability of young and senile dogs and evaluate the effects of advanced glycation ending products, oxidation protein and oxidative stress on seminal cryopreservation of senile dogs. Twenty two dogs were selected and allocated into two experimental groups according to their age: Young Group (n=11) and Senile Group (n=11). These groups were additionally divided into Fresh Semen Group and Frozen Semen Group. Age distribution was performed according to the size of the animals, being small animals considered senile from 8 years of age onwards, medium size from 7 years old and large size over 6 years old. Regardless of the body size, dogs were considered young if they were at reproductive maturity from 1 to 5 years old. The Fresh Group was subjected to immediate seminal assessments, including volume, color, aspect of the ejaculate, sperm concentration and computer analysis of sperm motility (CASA). Then morpho-functional assessments were carried out, including sperm mitochondrial activity, lipid oxidative stress, protein oxidative stress, dosage of advanced glycation ending products and of protein concentration, flow cytometry using fluorescent probes to evaluate plasmatic and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential and DNA fragmentation analysis. The semen from the Frozen Group was submitted to one step freezing protocol and samples were thawed after not less than 1 week at 37°C for 30 seconds and evaluated for sperm concentration, motility computerized analysis (CASA) and same the morpho-functional analysis performed for the Young Group. Male dogs from the Young Group presented higher libido score, parameters of sperm motility, percentage of sperm with high mitochondrial activity and lower percentage of sperm of medium mitochondrial activity, total spermatic defects, major spermatic defects and proximal cytoplasmic droplet. For the fresh semen of the Young Group, higher values of acrosomal membrane integrity and low mitochondrial membrane potential, as well as lower values of plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential were noticed. In the post-thaw semen, the Young Group showed higher values of spermatic acrosomal membrane integrity. For the semen of young dogs, the Fresh Group had higher values of acrosomal membrane integrity and acrosomal membrane integrity with plasma membrane damage. In the semen of senile dogs, the Fresh Group presented higher values of acrosomal membrane integrity, plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential, as well as lower percentage of sperm with low mitochondrial membrane potential. Comparing sub-groups, higher values for sperm motility parameters, plasma membrane integrity with acrosome injury, medium mitochondrial membrane potential, plasmatic membrane integrity, high mitochondrial activity and oxidative stress was noticed for the Thawed group, as well as greater values of lateral displacement amplitude of the sperm head, static spermatozoa, acrosomal and plasmatic membrane lesions, medium mitochondrial activity and protein concentration in the spermatozoa pellet. Based on the present results, it is possible to conclude that the semen of senile dogs presents inferior quality compared to young dogs, as well as less freezability. The possible failure to eliminate the sperm cytoplasmic droplet in senile dogs sperm promotes mitochondrial dysfunctions, culminating to alterations on sperm motility. Finally, the evaluation of oxidative parameters is not feasible for the impact evaluation of reproductive senescence.