Protective Immunity of COVID-19 Vaccination with ChAdOx1 nCoV-19 Following Previous SARS-CoV-2 Infection: A Humoral and Cellular Investigation.

Infections caused by SARS-CoV-2 induce a severe acute respiratory syndrome called COVID-19 and have led to more than six million deaths worldwide. Vaccination is the most effective preventative measure, and cellular and humoral immunity is crucial to developing individual protection. Here, we aim to investigate hybrid immunity against SARS-CoV-2 triggered by the ChAadOx1 nCoV-19 vaccine in a Brazilian cohort. We investigated the immune response from ChAadOx1 nCoV-19 vaccination in naïve (noCOVID-19) and previously infected individuals (COVID-19) by analyzing levels of D-dimers, total IgG, neutralizing antibodies (Nabs), IFN-γ (interferon-γ) secretion, and immunophenotyping of memory lymphocytes. No significant differences in D-dimer levels were observed 7 or 15 days after vaccination (DAV). All vaccinated individuals presented higher levels of total IgG or Nabs with a positive correlation (R = 0.88). Individuals in the COVID-19 group showed higher levels of antibody and memory B cells, with a faster antibody response starting at 7 DAV compared to noCOVID-19 at 15 DAV. Further, ChAadOx1 nCoV-19 vaccination led to enhanced IFN-γ production (15 DAV) and an increase in activated T CD4+ naïve cells in noCOVID-19 individuals in contrast with COVID-19 individuals. Hence, our data support that hybrid immunity triggered by ChAadOx1 nCoV-19 vaccination is associated with enhanced humoral response, together with a balanced cellular response.

Desenvolvimento de controles de processo para a produção de conjugado de anticorpo anti-IgG canina com peroxidase de raiz forte utilizado no kit para detecção de leishmaniose canina

Leishmaniose é uma doença endêmica presente em mais de 80 países no mundo incluindo o Brasil, tornando-se um grave problema de saúde pública no mundo. A leishmaniose visceral (LV) causada pelo parasito Leishmania chagasi é uma doença que ocorre em seres humanos sendo cães um dos reservatórios do parasito. Dessa forma, o diagnóstico canino é essencial para os programas de vigilância da LV. No Brasil, o controle da LV é realizado pelo Ministério da Saúde, no qual preconiza a eutanásia de cães soropositivos, o controle do vetor, o diagnóstico precoce e o tratamento de casos humanos. No entanto, o impacto dessas medidas não tem surtido o efeito esperado na redução de casos humanos. Neste sentido, o correto diagnóstico é um importante passo para evitar a eutanásia desnecessária de cães e a transmissão da doença, pois assim evita-se que o cão infectado permaneça no ambiente como fonte de infecção. Bio-Manguinhos possui uma ampla linha de reativos para diagnóstico, dentre eles o Ensaio Imunoenzimático (Elisa) para diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (EIE-LVC), o qual apresenta a possibilidade de diagnóstico em larga escala, melhor leitura e interpretação dos resultados quando comparado a outros testes sorológicos. Para competir com os demais produtos que atuam no mercado são necessários novos estudos que possam melhorar a eficiência e qualidade do kit (EIE-LVC). Nesta dissertação algumas estratégias foram estabelecidas e técnicas foram otimizadas para a produção de conjugados de anticorpos anti-IgG canina marcados com peroxidase (IgG-HRP) produzidos na Seção de Insumos, Conjugados e Apoio (SEICA)/Bio-Manguinhos. Neste estudo a obtenção da IgG foi realizada pelas etapas de precipitação com sulfato de amônio, dessalinização em cromatografia de exclusão e peneiração molecular (SEC) e purificação por cromatografia de troca aniônica em coluna Poros HQ. A imunoglobulina purificada foi analisada por SDS-PAGE, IEF-PAGE e quantificada pelo método de BCA. A conjugação da IgG purificada à HRP foi realizada através da metodologia de aminação redutiva, utilizando diferentes concentrações de metaperiodato de sódio e borohidreto de Sódio. Após a obtenção dos conjugados, estes foram avaliados quanto à conformação através de SEC, dicroísmo circular e espectrometria de fluorescência e caracterizados imunologicamente através de Elisa. A estabilidade dos conjugados foi avaliada através de curvas de desnaturação térmica e por testes de estabilidade acelerada. Os ensaios de monitoramento conformacional indicam que os conjugados apresentam uma grande estabilidade conformacional. Os ensaios de estabilidade acelerada ocorreram em três condições de temperatura a 4ºC, 37ºC e 50ºC, utilizando o estabilizante comercial Guardian™ em substituição ao estabilizante clássico do kit e placas preparadas para estocagem a 4ºC. A eficiência dos conjugados nestas condições foi avaliada por meio de Elisa frente a placas previamente sensibilizadas com antígeno de LV, contra soros positivos e negativos de painéis sorológicos padronizados utilizados no diagnóstico canino. Nossos dados de estabilidade acelerada indicam que os conjugados mantiveram a eficiência no reconhecimento dos anticorpos, mesmo em altas temperaturas, evidenciando que estes possuem estabilidade compatível para armazenamento a temperatura de 2ºC a 8ºC. Ao comparar os conjugados obtidos sob as novas condições com o conjugado clássico verificamos que ambos são capazes de distinguir as amostras positivas e negativas. Sendo assim, a implantação das novas estratégias demonstradas nesta dissertação podem ser utilizadas para aumentar a validade dos kits e facilitar o processo de produção.

Proposta de metodologias para o controle de matérias-primas a serem utilizadas na produção de conjugados de anticorpos policlonais de cabra com peroxidase de raiz

Os reagentes para diagnóstico são baseados em reações químicas, bioquímicas e imunológicas, para a obtenção de resultados para a avaliação clínica de determinadas patologias. Entre os imunoensaios, o ensaio imunoenzimático (EIE) é um dos métodos mais utilizados para o diagnóstico de diversas doenças. Bio-Manguinhos produz e distribui kits de EIE para o Ministério da Saúde, estes kits são compostos de placas ELISA revestidas com antígenos específicos, soros controle positivos e negativos, cromógeno (tetrametilbenzidina), peróxido de hidrogênio, imunoglobulina G anti-IgG humana ou anti-IgG canina conjugada com peroxidase e soluções para a execução do método. Embora as metodologias que culminam na produção dos kits EIE sejam bem definidas, alguns controles de processos não foram padronizados ou devem ser revistos. Nesse sentido, duas metodologias ­ espectroscopia por UV e quantificação da atividade enzimática - foram testadas para avaliar três compostos utilizados no processo de conjugação e na etapa da revelação de EIE ­ TMB, água oxigenada e peroxidase respectivamente. Os controles da quantidade de TMB e peróxido de hidrogênio foram feitos por espectrofotometria de UV, utilizando como parâmetro o coeficiente de extinção destas espécies. Esta metodologia provou ser mais rápida que a titulação de peróxido de hidrogênio realizada pelo Laboratório de Controle Físico-Químico. A avaliação de diversos lotes de TMB mostrou que o método proposto pode ser utilizado como parâmetro de controle de insumos intermediários, evitando o retrabalho ou reprovação de um lote inteiro do reativo para diagnóstico. O controle proposto para a enzima peroxidase foi a quantificação da atividade enzimática, utilizando como substrato pirogalol. Neste caso, os lotes da enzima com atividade biológica menor que a descrita pelo fornecedor, podem ser eliminados para evitar desperdício de tempo e de reagentes utilizados no processo de conjugação. Os controles sugeridos nesta dissertação podem oferecer uma melhor qualidade do produto final e diminuir o número de lotes reprovados.