Validation of a flow cytometry based binding assay for evaluation of monoclonal antibody recognizing EGF receptor.

An ideal test used to characterize a product must be appropriate for the measurement of product quality, manufacturing consistency, product stability, and comparability studies. Flow cytometry has been successfully applied to the examination of antibodies and receptors on membrane surfaces; however, to date, the analytical validation of cytometry based assays is limited. Here we report on the validation of a flow cytometry-based assay used in the evaluation of nimotuzumab binding to cells over-expressing EGFR on cell surface. The assay was validated by examining, assay robustness, specificity, repeatability and intermediate precision. The assay was highly specific, robust for all studied factors except for cell fixation with 1% paraformaldehyde and met criteria for precision with RSD < 2%. In addition the assay has stability-indicating properties evidenced by the ability to detect changes in mAb degraded samples. Most importantly, the assay demonstrated to be useful for its intended use.

Detección inmunohistoquímica del receptor del factor de crecimiento epidérmico: revisión de algunos aspectos técnicos relacionados / Immunohistochemical detection of the epidermal growth factor receptor: review of some related technical aspects

Introducción: En los últimos años la inmunohistoquímica (IHQ) se ha convertido en el método más usado en la determinación de la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (REGF). La falta de control de algunos aspectos técnicos durante su determinación en muestras de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina, como por ejemplo, la fijación tisular y el procesamiento de las muestras, la elección de un método adecuado de reanimación antigénica, el empleo de diferentes anticuerpos anti-REGF y sistemas de detección, a llegado a tal punto que la confiabilidad y reproducibilidad de la detección inmunohistoquímica de la sobreexpresión del REGF está siendo fuertemente cuestionada. Objetivo: La estandarización de estos procedimientos constituye una de las metas más perseguidas actualmente, con el objetivo de continuar empleando la sobreexpresión del REGF por IHQ como criterio de elección y predictor de la respuesta al tratamiento, sin necesidad de recurrir a técnicas más complejas para su detección, disminuyendo en gran medida a la variabilidad intra e interlaboratorios. Métodos: Revisión y determinación de la pertinencia en el control de la técnica investigativa y viabilidad de la misma. Conclusiones: La determinación de la sobreexpresión del REGF por IHQ continúa siendo el método más empleado actualmente como predictor de la respuesta a la terapia contra el receptor. La heterogeneidad de las muestras, la falta de estandarización de los procedimientos inmunohistoquímicos empleados, la existencia de numerosos protocolos con un mismo fin, así como otras fuentes de variabilidad, han conducido a la obtención de resultados poco confiables y reproducibles(AU)

Background: In recent years, immunohistochemistry (IHC) has become the most widely used method in determining the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR). The lack of control of some technical aspects during their determination in formaldehyde fixed and paraffin embedded tissue such as tissue fixation and sample processing, the choice of a suitable antigen retrieval method, the use of different anti-EGFR antibodies and the detection systems have come to the point that the reliability and reproducibility of the imunohistochemical analysis of EGFR overexpression is being seriously questioned. Objective: The standardization of these procedures is one of most pursued goals at present, with the aim to continue using EGFR overexpression by IHC as selection criteria and predictor of treatment response, without resorting to most complex techniques for its detection, greatly diminishing the intra and inter laboratory variation. Methods: A review and determination of the relevance in the control of the investigative technique and its feasibility was made. Conclusions: The determination of EGFR overexpression by IHC continues being the most used method at present as predictor of the response to the therapy against the receptor. The heterogeneity of the samples, the lack of standardization of the most used immunohistochemical procedures, the existence of several protocols with the same goal, as well as other sources of variability have led to obtaining hardly reliable and reproducible results(AU)

Detección inmunohistoquímica del receptor del factor de crecimiento epidérmico: revisión de algunos aspectos técnicos relacionados / Immunohistochemical detection of the epidermal growth factor receptor: review of some related technical aspects

Introducción: En los últimos años la inmunohistoquímica (IHQ) se ha convertido en el método más usado en la determinación de la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (REGF). La falta de control de algunos aspectos técnicos durante su determinación en muestras de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina, como por ejemplo, la fijación tisular y el procesamiento de las muestras, la elección de un método adecuado de reanimación antigénica, el empleo de diferentes anticuerpos anti-REGF y sistemas de detección, a llegado a tal punto que la confiabilidad y reproducibilidad de la detección inmunohistoquímica de la sobreexpresión del REGF está siendo fuertemente cuestionada. Objetivo: La estandarización de estos procedimientos constituye una de las metas más perseguidas actualmente, con el objetivo de continuar empleando la sobreexpresión del REGF por IHQ como criterio de elección y predictor de la respuesta al tratamiento, sin necesidad de recurrir a técnicas más complejas para su detección, disminuyendo en gran medida a la variabilidad intra e interlaboratorios. Métodos: Revisión y determinación de la pertinencia en el control de la técnica investigativa y viabilidad de la misma. Conclusiones: La determinación de la sobreexpresión del REGF por IHQ continúa siendo el método más empleado actualmente como predictor de la respuesta a la terapia contra el receptor. La heterogeneidad de las muestras, la falta de estandarización de los procedimientos inmunohistoquímicos empleados, la existencia de numerosos protocolos con un mismo fin, así como otras fuentes de variabilidad, han conducido a la obtención de resultados poco confiables y reproducibles

Background: In recent years, immunohistochemistry (IHC) has become the most widely used method in determining the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR). The lack of control of some technical aspects during their determination in formaldehyde fixed and paraffin embedded tissue such as tissue fixation and sample processing, the choice of a suitable antigen retrieval method, the use of different anti-EGFR antibodies and the detection systems have come to the point that the reliability and reproducibility of the imunohistochemical analysis of EGFR overexpression is being seriously questioned. Objective: The standardization of these procedures is one of most pursued goals at present, with the aim to continue using EGFR overexpression by IHC as selection criteria and predictor of treatment response, without resorting to most complex techniques for its detection, greatly diminishing the intra and inter laboratory variation. Methods: A review and determination of the relevance in the control of the investigative technique and its feasibility was made. Conclusions: The determination of EGFR overexpression by IHC continues being the most used method at present as predictor of the response to the therapy against the receptor. The heterogeneity of the samples, the lack of standardization of the most used immunohistochemical procedures, the existence of several protocols with the same goal, as well as other sources of variability have led to obtaining hardly reliable and reproducible results

Relación histopatológica de la displasia epitelial con la oncoproteína p53 en la leucoplasia bucal / Histopathological relation of epithelial dysplasia to p53 oncoprotein in oral leukoplakia

La leucoplasia bucal es una lesión precancerosa bien conocida debido a su asociación con la presencia de displasia epitelial y su tendencia a la transformación maligna. Con el fin de eliminar la subjetividad en la determinación de los grados de la displasia epitelial se han utilizado marcadores biológicos, entre ellos, el AcM anti p53. Por ello se propuso evaluar la expresión del AcM anti p53 en los diferentes grados de displasia epitelial en la leucoplasia bucal. Se emplearon las biopsias de 46 pacientes con diagnóstico de leucoplasia bucal, procedentes del Departamento de Patología Bucal de la Facultad de Estomatología de La Habana. Las muestras fueron procesadas por la técnica de inclusión en parafina y coloreadas con la técnica inmunohistoquímica del complejo avidina-biotina-peroxidasa para el AcM p53. Se estudió la correlación entre el patrón de inmunoensayo para p53 y el grado de displasia epitelial. Se evidenció que existe una asociación significativa entre la inmunocoloración de las células basales y suprabasales del epitelio con la oncoproteína p53, en los distintos grados de severidad de la displasia epitelial, lo que pudiera estar relacionado con el incremento progresivo de atipia celular observada. Se concluyó que en las muestras estudiadas existió una relación coincidente del aumento del grado de severidad de la displasia epitelial, con el marcaje de la oncoproteína p53. Estas evidencias sugirieron que el análisis inmunohistoquímico de p53 en conjunto con los parámetros histológicos, principalmente relacionados con el grado de severidad de la displasia epitelial, pudiera ser utilizado para lograr un diagnóstico más certero y contribuir a la prevención del cáncer bucal.(AU)

The oral leukoplasia is a well known precancerous injury due to its association with the presence of epithelial dysplasia and its trend to malignant transformation. To eliminate the subjectivity in the determination of the epithelial dysplasia degrees, biological markers have been used among them the AcM.antip53 Thus, authors assessed the expression of AcM antip53 in the different degrees of epithelial dysplasia in the oral leukoplasia. Biopsies from 46 patients diagnosed with oral leukoplasia were used from the Oral Pathology Department of the Stomatology Faculty of La Habana. Samples were processed by the paraffin-inclusion technique and stained with immunohistochemical technique of the avidin-biotin-peroxidase complex for the AcM p53. The correlation between the immunoassay pattern for p53 and the degree of epithelial dysplasia was studied. It was demonstrated that there is a significant association between the immunostain of basal and supra-basal cells of epithelium with the p53 oncoprotein in the different degrees of severity of the epithelial dysplasia, which could be related to the progressive increase of the observed cellular atypia. We concluded that in the study samples there was a coincident relation of the increase in the degree of severity of the epithelial dysplasia, with the marking of the p53 oncoprotein. These evidences suggested that the immunohistochemical analysis of p53 overall with the histological parameters mainly those related to the degree of severity of the epithelial dysplasia could be used to made a more accurate diagnosis and to contribute to prevention of oral cancer.(AU)

Relación histopatológica de la displasia epitelial con la oncoproteína p53 en la leucoplasia bucal / Histopathological relation of epithelial dysplasia to p53 oncoprotein in oral leukoplakia

La leucoplasia bucal es una lesión precancerosa bien conocida debido a su asociación con la presencia de displasia epitelial y su tendencia a la transformación maligna. Con el fin de eliminar la subjetividad en la determinación de los grados de la displasia epitelial se han utilizado marcadores biológicos, entre ellos, el AcM anti p53. Por ello se propuso evaluar la expresión del AcM anti p53 en los diferentes grados de displasia epitelial en la leucoplasia bucal. Se emplearon las biopsias de 46 pacientes con diagnóstico de leucoplasia bucal, procedentes del Departamento de Patología Bucal de la Facultad de Estomatología de La Habana. Las muestras fueron procesadas por la técnica de inclusión en parafina y coloreadas con la técnica inmunohistoquímica del complejo avidina-biotina-peroxidasa para el AcM p53. Se estudió la correlación entre el patrón de inmunoensayo para p53 y el grado de displasia epitelial. Se evidenció que existe una asociación significativa entre la inmunocoloración de las células basales y suprabasales del epitelio con la oncoproteína p53, en los distintos grados de severidad de la displasia epitelial, lo que pudiera estar relacionado con el incremento progresivo de atipia celular observada. Se concluyó que en las muestras estudiadas existió una relación coincidente del aumento del grado de severidad de la displasia epitelial, con el marcaje de la oncoproteína p53. Estas evidencias sugirieron que el análisis inmunohistoquímico de p53 en conjunto con los parámetros histológicos, principalmente relacionados con el grado de severidad de la displasia epitelial, pudiera ser utilizado para lograr un diagnóstico más certero y contribuir a la prevención del cáncer bucal(AU)

The oral leukoplasia is a well known precancerous injury due to its association with the presence of epithelial dysplasia and its trend to malignant transformation. To eliminate the subjectivity in the determination of the epithelial dysplasia degrees, biological markers have been used among them the AcM.antip53 Thus, authors assessed the expression of AcM antip53 in the different degrees of epithelial dysplasia in the oral leukoplasia. Biopsies from 46 patients diagnosed with oral leukoplasia were used from the Oral Pathology Department of the Stomatology Faculty of La Habana. Samples were processed by the paraffin-inclusion technique and stained with immunohistochemical technique of the avidin-biotin-peroxidase complex for the AcM p53. The correlation between the immunoassay pattern for p53 and the degree of epithelial dysplasia was studied. It was demonstrated that there is a significant association between the immunostain of basal and supra-basal cells of epithelium with the p53 oncoprotein in the different degrees of severity of the epithelial dysplasia, which could be related to the progressive increase of the observed cellular atypia. We concluded that in the study samples there was a coincident relation of the increase in the degree of severity of the epithelial dysplasia, with the marking of the p53 oncoprotein. These evidences suggested that the immunohistochemical analysis of p53 overall with the histological parameters mainly those related to the degree of severity of the epithelial dysplasia could be used to made a more accurate diagnosis and to contribute to prevention of oral cancer(AU)

Caracterización histopatológica de la leucoplasia bucal en La Habana durante 10 años / Histopathological characterization in the leukoplakia buccalis in Havana during 10 years

La displasia epitelial es considerada el más fuerte predictor histológico de la futura transformación maligna de la leucoplasia bucal. El objetivo del presente trabajo fue determinar la presencia y severidad de la displasia epitelial y su asociación con las alteraciones histológicas de los tejidos epitelial y conectivo de la mucosa en la leucoplasia bucal. Se efectuó una investigación descriptiva y transversal de 83 biopsias procesadas mediante la técnica de inclusión en parafina y coloreadas con hematoxilina y eosina, de pacientes con diagnóstico de leucoplasia bucal entre los años 1991 y 2001, procedentes de la Facultad de Estomatología de la Universidad de Ciencias Médicas de La Habana, Cuba. Se encontró que 92,8 por ciento de los pacientes con diagnóstico clínico de esta enfermedad tuvieron displasia epitelial, de estos y acorde a su grado de severidad, se encontró displasia epitelial ligera en 53,0 por ciento, displasia epitelial moderada en 36,4 por ciento y displasia epitelial severa en 10,4 por ciento. La paraqueratosis se manifestó como sigue: asociada a la displasia epitelial ligera en 43,9 por ciento de los pacientes, a la displasia epitelial moderada en 78,6 por ciento y a la displasia epitelial severa en 100,0 por ciento. La hiperplasia epitelial se presentó en 57,1 por ciento de los casos y el infiltrado inflamatorio en 79,2 por ciento de las muestras examinadas. Se concluyó que en la muestra de leucoplasia bucal estudiada existió un porcentaje elevado de displasia epitelial, con predominio de su grado ligero y una asociación entre el grado de severidad con los diversos patrones de queratinización y la intensidad del infiltrado inflamatorio, lo que se consideró importante al analizar su evolución ante un diagnóstico determinado y su pronóstico.(AU)

The epithelial dysplasia is considered the stronger predictor of a future malignant transformation of the leukoplakia buccalis. The aim of present paper was to determine the presence and severity of this type of dysplasia and its association with the histological alterations of epithelial and connective tissues of mucosa in the leukoplakia buccalis. A cross-sectional and descriptive research was conducted in 83 biopsies processed by technique of paraffin inclusion and stained with Hematoxylin and Eosin of patients diagnosed with this entity between 1991-2001 from the Stomatology Faculty of the Medical Sciences University of La Habana. The 92.8 percent of patients with a clinical diagnosis of leukoplakia buccalis had slight epithelial dysplasia, from these and according to its grade of severity, there was found a slight epithelial dysplasia in the 53.0 percent, moderate epithelial dysplasia in the 36.4 percent and a severe epithelial dysplasia in 10.4 percent. The parakeratosis was manifested in the 43.9 percent associated with a slight epithelial dysplasia, 78.6 percent with a moderate dysplasia and in the 100 percent with the severe one. The epithelial dysplasia was present in the 57.1 percent of cases and the inflammatory infiltrate in the 79.2 percent of study samples. Authors conclude that in the study sample of leukoplakia buccalis there is a high percentage of epithelial dysplasia with predominance of its slight degree and a association between its severity degree with the different patterns of keratinization and the intensity of inflammatory infiltrate, something important in the analysis of its course in face a determined diagnosis y its prognosis.(AU)

Caracterización histopatológica de la leucoplasia bucal en La Habana durante 10 años / Histopathological characterization in the leukoplakia buccalis in Havana during 10 years

La displasia epitelial es considerada el más fuerte predictor histológico de la futura transformación maligna de la leucoplasia bucal. El objetivo del presente trabajo fue determinar la presencia y severidad de la displasia epitelial y su asociación con las alteraciones histológicas de los tejidos epitelial y conectivo de la mucosa en la leucoplasia bucal. Se efectuó una investigación descriptiva y transversal de 83 biopsias procesadas mediante la técnica de inclusión en parafina y coloreadas con hematoxilina y eosina, de pacientes con diagnóstico de leucoplasia bucal entre los años 1991 y 2001, procedentes de la Facultad de Estomatología de la Universidad de Ciencias Médicas de La Habana, Cuba. Se encontró que 92,8 por ciento de los pacientes con diagnóstico clínico de esta enfermedad tuvieron displasia epitelial, de estos y acorde a su grado de severidad, se encontró displasia epitelial ligera en 53,0 por ciento, displasia epitelial moderada en 36,4 por ciento y displasia epitelial severa en 10,4 por ciento. La paraqueratosis se manifestó como sigue: asociada a la displasia epitelial ligera en 43,9 por ciento de los pacientes, a la displasia epitelial moderada en 78,6 por ciento y a la displasia epitelial severa en 100,0 por ciento. La hiperplasia epitelial se presentó en 57,1 por ciento de los casos y el infiltrado inflamatorio en 79,2 por ciento de las muestras examinadas. Se concluyó que en la muestra de leucoplasia bucal estudiada existió un porcentaje elevado de displasia epitelial, con predominio de su grado ligero y una asociación entre el grado de severidad con los diversos patrones de queratinización y la intensidad del infiltrado inflamatorio, lo que se consideró importante al analizar su evolución ante un diagnóstico determinado y su pronóstico.

The epithelial dysplasia is considered the stronger predictor of a future malignant transformation of the leukoplakia buccalis. The aim of present paper was to determine the presence and severity of this type of dysplasia and its association with the histological alterations of epithelial and connective tissues of mucosa in the leukoplakia buccalis. A cross-sectional and descriptive research was conducted in 83 biopsies processed by technique of paraffin inclusion and stained with Hematoxylin and Eosin of patients diagnosed with this entity between 1991-2001 from the Stomatology Faculty of the Medical Sciences University of La Habana. The 92.8 percent of patients with a clinical diagnosis of leukoplakia buccalis had slight epithelial dysplasia, from these and according to its grade of severity, there was found a slight epithelial dysplasia in the 53.0 percent, moderate epithelial dysplasia in the 36.4 percent and a severe epithelial dysplasia in 10.4 percent. The parakeratosis was manifested in the 43.9 percent associated with a slight epithelial dysplasia, 78.6 percent with a moderate dysplasia and in the 100 percent with the severe one. The epithelial dysplasia was present in the 57.1 percent of cases and the inflammatory infiltrate in the 79.2 percent of study samples. Authors conclude that in the study sample of leukoplakia buccalis there is a high percentage of epithelial dysplasia with predominance of its slight degree and a association between its severity degree with the different patterns of keratinization and the intensity of inflammatory infiltrate, something important in the analysis of its course in face a determined diagnosis y its prognosis.

Inmunorreacción de los anticuerpos monoclonales A3, E1 y P3 en tejido normal / Immunoreaction of the monoclonal antibodies A3, E1 and P3 in normal tissue

Conocer el reconocimiento tisular en órganos normales de estos anticuerpos monoclonales (AcMs) dirigidos contra moléculas de gangliósidos es importante como parte de su evaluación para uso diagnóstico. Las muestras fueron procesadas frescas y posteriormente fijadas en paraformaldehído. Los 3 sobrenadantes de cultivo se trabajaron puros y en todos los experimentos se utilizaron controles negativos y positivos. Los 3 AcMs reaccionaron con células del epitelio intestinal y el tejido conectivo de la submucosa. Los antígenos A3 y E1 se localizaron también en el epitelio traqueobronquial. El AcM E1 reaccionó con los epitelios renal y prostático que el A3 lo hizo en la epidermis y los ganglios autónomos mientéricos. La inmunotinción de las secreciones renales e intestinales con estos AcMs junto a las características del marcaje tisular pudieron sugerir la naturaleza de estos antígenos

Mesotelioma pleural: presentación de tres pacientes y revisón de la literatura / Preural mesothelioma: presentation of theree patients ans review of literature

Se presenta tres pacientes con diagnóstico de mesotelioma preural, inscriptos en el INOR, Uno con diagnóstico inicial de mesotelioma pleural solitario, fibroso de la pleura, el que diecinueve meses después evluciona a metástasis con partes blandas y pulmonares perdiéndose de la consulta. El segundo con diagnóstico histológico de adenocarcinoma metástasico, y que al morir el diagnóstico de la necropsia demostró un mesotelioma difuso de la pleura. El tercero, su diagnóstico de la necropsia demostró un mesotelioma difuso de la pleura. Se procede ha hacer estudios histoquímicos de las biopsias y/o de la necropsia, destacándose la importancia de estos métodos como de gran ayuda en el diagnóstico de los mesoteliomas difusos de la pleura. La supervivencia para los dos pacientes fue de 12 a 14 meses. Un caso se perdió del seguimiento diecinueve meses después de su primera consulta, presentando signos de metástasis en partes blandas y pleuropulmonares

Estudio comparativo de las subpoblaciones de linfocitos T en carcinomas de la piel / Comparative studies of T lymphocyte subpopulations in skin carcinoma

Se estudiaron 50 carcinomas basocelulares y 30 epidermoides de piel empleando anticuerpos monoclonales IOR para identificar in situ las subpoblaciones de linfocitos T en el infiltrado reaccional de células mononucleares presentes en estos tumores. Se encontró de moderada a escasa cantidad de linfocitos T CD4+ en estos carcinomas, mientras que los CD8 + eran escasos en ambos. No se observó diferencia significativa en el comportamiento de las subpoblaciones de linfocitos T entre estos 2 tumores.

Mesotelioma pleural: presentación de tres pacientes y revisón de la literatura / Preural mesothelioma: presentation of theree patients ans review of literature

Se presenta tres pacientes con diagnóstico de mesotelioma preural, inscriptos en el INOR, Uno con diagnóstico inicial de mesotelioma pleural solitario, fibroso de la pleura, el que diecinueve meses después evluciona a metástasis con partes blandas y pulmonares perdiéndose de la consulta. El segundo con diagnóstico histológico de adenocarcinoma metástasico, y que al morir el diagnóstico de la necropsia demostró un mesotelioma difuso de la pleura. El tercero, su diagnóstico de la necropsia demostró un mesotelioma difuso de la pleura. Se procede ha hacer estudios histoquímicos de las biopsias y/o de la necropsia, destacándose la importancia de estos métodos como de gran ayuda en el diagnóstico de los mesoteliomas difusos de la pleura. La supervivencia para los dos pacientes fue de 12 a 14 meses. Un caso se perdió del seguimiento diecinueve meses después de su primera consulta, presentando signos de metástasis en partes blandas y pleuropulmonares

Inmunorreacción de los anticuerpos monoclonales A3, E1 y P3 en tejido normal / Immunoreaction of the monoclonal antibodies A3, E1 and P3 in normal tissue

Conocer el reconocimiento tisular en órganos normales de estos anticuerpos monoclonales (AcMs) dirigidos contra moléculas de gangliósidos es importante como parte de su evaluación para uso diagnóstico. Las muestras fueron procesadas frescas y posteriormente fijadas en paraformaldehído. Los 3 sobrenadantes de cultivo se trabajaron puros y en todos los experimentos se utilizaron controles negativos y positivos. Los 3 AcMs reaccionaron con células del epitelio intestinal y el tejido conectivo de la submucosa. Los antígenos A3 y E1 se localizaron también en el epitelio traqueobronquial. El AcM E1 reaccionó con los epitelios renal y prostático que el A3 lo hizo en la epidermis y los ganglios autónomos mientéricos. La inmunotinción de las secreciones renales e intestinales con estos AcMs junto a las características del marcaje tisular pudieron sugerir la naturaleza de estos antígenos (AU)