Neutrophil Oxidative Burst Profile Is Related to a Satisfactory Response to Itraconazole and Clinical Cure in Feline Sporotrichosis.

Despite the central role of cats in the transmission and amplification of Sporothrix, studies regarding immune response in feline sporotrichosis are scarce. In cats with sporotrichosis, neutrophil-rich lesions are usually associated to good general condition and lower fungal burden. However, the role of neutrophils in anti-Sporothrix immunity has been little explored in cats. Thus, the aim of this study was to evaluate the neutrophil oxidative burst in the blood of cats with sporotrichosis. Cats with sporotrichosis included in the study were treated with itraconazole (ITZ) alone or combined with potassium iodide (KI). The neutrophil oxidative burst was evaluated through a flow-cytometry-based assay using dihydrorhodamine 123 (background) and stimulation with Zymosan and heat-killed Sporothrix yeasts. The cure rate was 50.0% in cats under treatment with ITZ monotherapy and 90.9% in cats treated with ITZ + KI (p = 0.014), endorsing the combination therapy as an excellent alternative for the treatment of feline sporotrichosis. Higher percentages of Sporothrix-stimulated neutrophils were associated with good general condition (p = 0.003). Higher percentages of Sporothrix- (p = 0.05) and Zymosan-activated (p = 0.014) neutrophils before and early in the treatment were related to clinical cure in ITZ-treated cats. The correlation between oxidative burst and successful use of KI could not be properly assessed given the low number of failures (n = 2) in this treatment group. Nasal mucosa involvement, typically linked to treatment failure, was related to lower percentages of activated neutrophils in the background at the treatment outcome (p = 0.02). Our results suggest a beneficial role of neutrophils in feline sporotrichosis and a positive correlation between neutrophil activation and the cure process in ITZ-treated cats.

Comparative study of amplification systems in immunoenzyme assays for the diagnosis of American tegumentary leishmaniasis.

We compared the accuracy and reliability of three amplification systems for enzyme immunoassays in the detection of specific IgG antibodies for the diagnosis of cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania (Viannia) braziliensis in patients from an endemic area in Rio de Janeiro, Brazil. Partially soluble antigens obtained from the promastigote forms of L. (V.) braziliensis were used. For development of the reaction, two chromogens, 1,2-orthophenylenediamine (OPD) and 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), and a fluorogen, 4-methylumbelliferylphosphate (MUP), were tested. The performance of each system was compared using the following parameters: accuracy, intraclass correlation coefficient (ICC), and area under the receiver operating characteristic (ROC) curve. Sensitivity was the same (97.4%) for all systems. The reliability was excellent (ICC = 98.6, 98.7, and 99.1%) and specificity was 93.7, 95.8, and 97.4% for OPD, MUP, and TMB, respectively, showing no statistical significance. Despite the absence of differences in the performance of the three systems, the use of TMB is suggested because of its operational advantages, such as low cost compared with fluorogens, easy manipulation, greater stability, and lower toxicity.

Differentiation between canine cutaneous and visceral leishmaniasis by the detection of immunoglobulin G specific for Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) chagasi antigens using flow cytometry.

Flow cytometry employing Leishmania (L.) chagasi (Lc) and L. (Viannia) braziliensis (Lb) antigen was used to establish the differential diagnosis between visceral (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL) in dogs. Flow cytometry permitted the detection of Leishmania-specific immunoglobulin G in sera from 19 dogs: nine with CL and 10 with VL. A significant difference in the percentage of positive staining was observed in sera from dogs with CL between the homologous antigen (69% for Lb) and the heterologous antigen (42% for Lc). However, this difference was not significant in sera from dogs with VL (61% for Lb and 73% for Lc). No significant staining was observed in control sera (0.6% for Lb and 0.4% for Lc) consisting of samples from healthy dogs, or in the group with sporotrichosis (1.8% for Lb and 1.5% for Lc), a differential diagnosis of CL. The results suggest that flow cytometry might be useful for the differentiation between CL and VL in dogs, with practical applications in areas where the two infections overlap.

Pneumococcal predictive proteins selected by microbial genomic approach are serotype cross-reactive and bind to host extracellular matrix proteins

O Streptococcus pneumoniae é um colonizador da nasofaringe humana, responsável pela maioria dos casos de pneumonia adquirida na comunidade e pode causar doenças não invasivas e invasivas. As vacinas atualmente disponíveis são específicas para sorotipo e o uso de proteínas recombinantes associadas à virulência é uma alternativa para compor vacinas e superar esses problemas. Em um trabalho anterior, descrevemos a identificação de proteínas em S. pneumoniae por vaccinologia reversa e a diversidade genética dessas proteínas em isolados clínicos. Foi possível purificar metade das 20 proteínas selecionadas na forma solúvel. A expressão dessas proteínas na superfície das células pneumocócicas foi confirmada por citometria de fluxo. Demonstramos que algumas dessas proteínas foram capazes de se ligar a proteínas da matriz extracelular e foram reconhecidas por soros de pacientes com infecção por meningite pneumocócica causada por vários sorotipos pneumocócicos. Nesse contexto, nossos resultados sugerem que essas proteínas podem desempenhar um papel na patogênese pneumocócica e podem ser consideradas como possíveis candidatos à vacina.

Aplicação da citometria de fluxo no controle de qualidade de insumos e processos utilizados no desenvolvimento de kits para diagnóstico

Ensaios baseados em microesferas tem sido alvo de inúmeros estudos na pesquisa básica e clínica, utilizando como metodologias tanto a citometria de fluxo como a plataforma de microarranjos líquidos. No entanto, ainda existe a necessidade de estudos que visem o desenvolvimento de metodologias de controle de qualidade de insumos e processos empregados nesses ensaios. Desta forma, a presente tese teve como objetivo principal desenvolver métodos aplicando a citometria de fluxo para avaliação de anticorpos ligados a fluorocromos e de processos de acoplamento de anticorpos e/ou antígenos a microesferas. A avaliação dos acoplamentos de anticorpos foi realizada através da citometria de fluxo tradicional e da citometria de fluxo quantitativa (CFQ). Conjugados anti-IgG-PE e anti-HBSAg-PE de diferentes fabricantes e lotes foram acoplados a microesferas e avaliados durante 18 meses. Os resultados mostraram que as melhores condições de acoplamento foram 5 µg/mL de anti-IgG-PE e 1:300 de anti-HBSAg-PE e que houve uma variação entre os lotes e fabricantes dos conjugados tanto na intensidade de fluorescência quanto na estabilidade. A CFQ se mostrou uma ferramenta fundamental para validação dos estudos de estabilidade. A avaliação dos acoplamentos de antígenos às microesferas foi tanto no citômetro de fluxo FACSCalibur quanto no equipamento LX200. Para tal, os diferentes antígenos foram acoplados às microesferas em distintas condições de acoplamento. Os resultados mostraram que a melhor condição de acoplamento foi 2 horas na presença de EDC/NHS. Além disso, todos os antígenos apresentaram uma queda significante da marcação durante os 18 meses de avaliação, sendo essa tendência de queda diferente entre as avaliações feitas nos equipamentos FACSCalibur e LX200. Comparando os resultados dos dois equipamentos, o LX200 apresentou resultados muito mais dispersos que o FACSCalibur. Desta forma, concluímos que a citometria de fluxo pode ser utilizada como uma importante ferramenta de controle de qualidade de insumos e processos utilizados em ensaios de microarranjos líquidos. Além disso, esse protocolo citofluorimétrico pode ser utilizado na avaliação e controle de qualidade de outros conjugados e processos utilizados em outras tecnologias.

Comparative study of amplification systems in immunoenzyme assays for the diagnosis of American tegumentary leishmaniasis

We compared the accuracy and reliability of three amplification systems for enzyme immunoassays in the detection of specific IgG antibodies for the diagnosis of cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania (Viannia) braziliensis in patients from an endemic area in Rio de Janeiro, Brazil. Partially soluble antigens obtained from the promastigote forms of L. (V.) braziliensis were used. For development of the reaction, two chromogens, 1,2-orthophenylenediamine (OPD) and 3,30 ,5,50-tetramethylbenzidine (TMB), and a fluorogen, 4-methylumbelliferylphosphate (MUP), were tested. The performance of each system was compared using the following parameters: accuracy, intraclass correlation coefficient (ICC), and area under the receiver operating characteristic (ROC) curve. Sensitivity was the same (97.4%) for all systems. The reliability was excellent (ICC 5 98.6, 98.7, and 99.1%) and specificity was 93.7, 95.8, and 97.4% for OPD, MUP, and TMB, respectively, showing no statistical significance. Despite the absence of differences in the performance of the three systems, the use of TMB is suggested because of its operational advantages, such as low cost compared with fluorogens, easy manipulation, greater stability, and lower toxicity.

Padronizaçäo da técnica citofluorimétrica de marcaçäo intracelular de citocinas em células de pacientes com Leishmaniose tegumentar americana

Os perfis de citocinas produzidas pelas células T durante as infecçöes por Leishmania têm um importante papel na regulaçäo da resposta imune. Neste trabalho, nós descrevemos um método para detectar IL-2, IL-4 E IFN-y intracelulares produzidas por células mononucleares de sangue periférico(PBMC) de pacientes com leishmaniose tegumentar Americana (LTA) após estimulaçäo in vitro com antígenos Leishmania Braziliensis (Aglb) ou Concanavalina A (ConA). Os estudos de cinética para detectar células produtoras de citocinas em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de indivíduos sadios estimuladas com ConA mostraram que o melhor momento para se detectar IL-2, IL-4 e IFN-y é 24 horas após a estimulaçäo com mitógeno. Por outro lado, a análise da cinética de produçäo de citocinas intracelulares em PBMC de pacientes com LTA sugere que o melhor momento para se detectar estas citocinas é após 16 horas de estimulaçäo das células em cultura com Aglb ou ConA. O programa Immuno-4 forneceu um método acurado para se quantificar células produtoras de citocinas após estímulo in vitro. O estudo da produçäo de citocinas por PBMC estimulados com Aglb de 16 pacientes com leishmaniose cutânea localizada(LCL), um paciente de leishmaniose cutânea disseminada (LCDis) e um de leishmaniose mucocutânea (LMC) sugere que na LCL e LMC exista uma produçäo mista de citocinas do tipo 1 e 2, enquanto na LCDis ocorria predominância de IL-4. Uma vez estabelecido, este método poderá ser utilizado para avaliar o papel funcional das subpopulaçöes de linfócitos T nas leishmanioses, através da determinaçäo simultânea do fenótipo celular e das citocinas por elas produzidas. (AU)

Padronizaçäo da técnica citofluorimétrica de marcaçäo intracelular de citocinas em células de pacientes com Leishmaniose tegumentar americana

Os perfis de citocinas produzidas pelas células T durante as infecçöes por Leishmania têm um importante papel na regulaçäo da resposta imune. Neste trabalho, nós descrevemos um método para detectar IL-2, IL-4 E IFN-y intracelulares produzidas por células mononucleares de sangue periférico(PBMC) de pacientes com leishmaniose tegumentar Americana (LTA) após estimulaçäo in vitro com antígenos Leishmania Braziliensis (Aglb) ou Concanavalina A (ConA). Os estudos de cinética para detectar células produtoras de citocinas em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de indivíduos sadios estimuladas com ConA mostraram que o melhor momento para se detectar IL-2, IL-4 e IFN-y é 24 horas após a estimulaçäo com mitógeno. Por outro lado, a análise da cinética de produçäo de citocinas intracelulares em PBMC de pacientes com LTA sugere que o melhor momento para se detectar estas citocinas é após 16 horas de estimulaçäo das células em cultura com Aglb ou ConA. O programa Immuno-4 forneceu um método acurado para se quantificar células produtoras de citocinas após estímulo in vitro. O estudo da produçäo de citocinas por PBMC estimulados com Aglb de 16 pacientes com leishmaniose cutânea localizada(LCL), um paciente de leishmaniose cutânea disseminada (LCDis) e um de leishmaniose mucocutânea (LMC) sugere que na LCL e LMC exista uma produçäo mista de citocinas do tipo 1 e 2, enquanto na LCDis ocorria predominância de IL-4. Uma vez estabelecido, este método poderá ser utilizado para avaliar o papel funcional das subpopulaçöes de linfócitos T nas leishmanioses, através da determinaçäo simultânea do fenótipo celular e das citocinas por elas produzidas. (AU)