Magnitude, breadth, and functional profile of T-cell responses during human immunodeficiency virus primary infection with B and BF viral variants.

The molecular pattern of the human immunodeficiency virus (HIV) epidemic in Argentina provides an appropriate scenario to study cellular immune responses in patients with non-clade B infection. We aimed to map T-cell responses in patients infected with BF recombinant variants and compare them with those of clade B patients. Sixteen recently infected patients were enrolled and grouped by viral subtype. Nef-specific responses were evaluated with a peptide matrix-based gamma interferon (IFN-gamma) enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay using B and BF overlapping peptides. Cross-clade and clade-specific responses were found. A correlation between B versus BF Nef-specific responses was identified. Detailed analysis at the single-peptide level revealed that BF patients show a narrower response but greater magnitude. Nef immunodominant responses agreed with previous publications, although the B loop was targeted at an unexpectedly high frequency. The putative HLA allele(s) restricting each positive response was determined. Single-peptide level screening with two different peptide sets uncovered discordant responses (mostly caused by peptide offsetting) and allowed detection of increased breadth. Positive responses identified by ELISPOT assay were further studied by intracellular cytokine staining. These were almost exclusively mediated by CD8 T cells. Characterization of concordant responses revealed that cells show distinct functional profiles, depending on the peptide presented. Last, quality (in terms of polyfunctionality) of T cells was associated with better viral replication containment. Overall, interclade differences in the frequency of epitopes recognized, structural domains targeted, and magnitude of responses were identified. Screening T-cell responses with multiple sets increased sensitivity. Further support for the notion of polyfunctional CD8(+) T-cell requirement to better control viral replication is also provided.

Apoptosis resistance in HIV-1 persistently-infected cells is independent of active viral replication and involves modulation of the apoptotic mitochondrial pathway.

BACKGROUND: HIV triggers the decline of CD4+ T cells and leads to progressive dysfunction of cell-mediated immunity. Although an increased susceptibility to cell death occurs during the acute phase of HIV infection, persistently-infected macrophages and quiescent T-cells seem to be resistant to cell death, representing a potential reservoir for virus production. RESULTS: Lymphoid (H9/HTLVIIIB and J1.1) and pro-monocytic (U1) HIV-1 persistently-infected cell lines were treated with hydrogen peroxide (H2O2) and staurosporine (STS) for 24 h, and susceptibility to apoptosis was evaluated and compared with uninfected counterparts (H9, Jurkat and U937 respectively). When exposed to different pro-apoptotic stimuli, all persistently-infected cell lines showed a dramatic reduction in the frequency of apoptotic cells in comparison with uninfected cells. This effect was independent of the magnitude of viral replication, since the induction of viral production in lymphoid or pro-monocytic cells by exposure to TNF-alpha or PMA did not significantly change their susceptibility to H2O2- or STS-induced cell death. A mechanistic analysis revealed significant diferences in mitochondrial membrane potential (MMP) and caspase-3 activation between uninfected and persistently-infected cells. In addition, Western blot assays showed a dramatic reduction of the levels of pro-apototic Bax in mitochondria of persistently-infected cells treated with H2O2 or STS, but not in uninfected cells. CONCLUSION: This study represents the first evidence showing that resistance to apoptosis in persistently-infected lymphoid and monocytic cells is independent of active viral production and involves modulation of the mitochondrial pathway. Understanding this effect is critical to specifically target the persistence of viral reservoirs, and provide insights for future therapeutic strategies in order to promote complete viral eradication.

Citometría de flujo: valores absolutos y relativos de células CD3 CD4 obtenidos con dos técnicas / Flow cytometry: absolute and relative values of CD3 CD4 cells obtained by two different techniques

Se compararon los valores absolutos y relativos de linfocitos CD4 con dos técnicas de inmunofluorescensia en paralelo, utilizando un citómetro de flujo: 1) Método Convencional (MC): incluye cuatro tubos por muestra y requiere los datos externos del hemograma para calcular el valor absoluto. 2) Método de Microesferas (MME): incluye un tubo y no depende de datos externos. Ambas técnicas se realizaron a partir de sangre periférica con lisis de eritrocitos en 10 muestras de individuos normales (N), 18 de pacientes con hemofilia (He) e infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV+) y 10 muestras de individuos HIV+ no He. Los resultados con la prueba de Wilcoxon para muestras pareadas mostraron diferencias significativas (p <0,05) entre ambas técnicas sólo para los valores absolutos del grupo normal, no así en los otros grupos ni para los valores relativos. Se observaron niveles consistentemente menores para el MME. Cuando los datos se redistribuyeron en cinco intervalos según los valores absolutos, no se encontraron diferencias significativas. La elección de una u otra técnica depende de las posibilidades de cada laboratorio. El MME es más rápido y simple, el MC permite realizar la confrontación de datos (cálculo directo de CD4 comparado con los datos obtenidos por substracción de CD8) dando confiabilidad al resultado (AU)

Citometría de flujo: valores absolutos y relativos de células CD3 CD4 obtenidos con dos técnicas / Flow cytometry: absolute and relative values of CD3 CD4 cells obtained by two different techniques

Se compararon los valores absolutos y relativos de linfocitos CD4 con dos técnicas de inmunofluorescensia en paralelo, utilizando un citómetro de flujo: 1) Método Convencional (MC): incluye cuatro tubos por muestra y requiere los datos externos del hemograma para calcular el valor absoluto. 2) Método de Microesferas (MME): incluye un tubo y no depende de datos externos. Ambas técnicas se realizaron a partir de sangre periférica con lisis de eritrocitos en 10 muestras de individuos normales (N), 18 de pacientes con hemofilia (He) e infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV+) y 10 muestras de individuos HIV+ no He. Los resultados con la prueba de Wilcoxon para muestras pareadas mostraron diferencias significativas (p <0,05) entre ambas técnicas sólo para los valores absolutos del grupo normal, no así en los otros grupos ni para los valores relativos. Se observaron niveles consistentemente menores para el MME. Cuando los datos se redistribuyeron en cinco intervalos según los valores absolutos, no se encontraron diferencias significativas. La elección de una u otra técnica depende de las posibilidades de cada laboratorio. El MME es más rápido y simple, el MC permite realizar la confrontación de datos (cálculo directo de CD4 comparado con los datos obtenidos por substracción de CD8) dando confiabilidad al resultado

Primer estudio multicéntrico realizado por el Grupo Rioplatense de Citometría de Flujo: control de calidad en las mediciones de subpoblaciones de linfocitos T / First multicentric study by Grupo Rioplatense de Citometría de Flujo : quality control of lymphocyte subsets

El control de calidad se efectuó sobre los valores obtenidos, relativos y absolutos, de linfocitos T y de sus subpoblaciones CD4+ y CD8+ en muestras de sangre de pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). El estudio incluyó dieciocho centros: diez utilizaron citómetros de flujo de Becton Dickinson, tres de Coulter y 5 de Ortho que representan a 17 laboratorios de Argentina y a uno de Uruguay. Los siguientes programas se utilizaron para analizar los datos : SimulSET, Paint a Gate (Becton Dickinson), Profile II, XL System (Coulter), ImmunoCount Trio y Combo Cytoron (Ortho). Se obtuvieron muestras de sangre periférica en horas de la mañana (8 a 10 hs) de 10 voluntarios normales (por serología y hemograma) y de 10 pacientes HIV positivos con valores previos de CD4 que variaron entre 200-350 células por microlito y fueron procesadas dentro de las 12 horas. Cada centro obtuvo los valores relativos con el procedimiento técnico habitual y el de los valores absolutos utilizando el hemograma propio. Además, en un contador hematológico Cell-Dyn 3500 se obtuvo para cada muestra el hemograma correspondiente considerado de referencia. Los valores absolutos medios, obtenidos en cada centro con el hemograma propio, para los linfocitos T y los de sus subpoblaciones fueron significativamente diferentes. No hubo diferencias significativas para los valores porcentuales entre los diferentes centros ni para los valores absolutos obtenidos con el hemograma de referencia. Concluimos que las diferencias en los valores absolutos de los linfocitos T y sus subpoblaciones dependen del recuento hematológico empleado. (AU)

Primer estudio multicéntrico realizado por el Grupo Rioplatense de Citometría de Flujo: control de calidad en las mediciones de subpoblaciones de linfocitos T / First multicentric study by Grupo Rioplatense de Citometría de Flujo : quality control of lymphocyte subsets

El control de calidad se efectuó sobre los valores obtenidos, relativos y absolutos, de linfocitos T y de sus subpoblaciones CD4+ y CD8+ en muestras de sangre de pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). El estudio incluyó dieciocho centros: diez utilizaron citómetros de flujo de Becton Dickinson, tres de Coulter y 5 de Ortho que representan a 17 laboratorios de Argentina y a uno de Uruguay. Los siguientes programas se utilizaron para analizar los datos : SimulSET, Paint a Gate (Becton Dickinson), Profile II, XL System (Coulter), ImmunoCount Trio y Combo Cytoron (Ortho). Se obtuvieron muestras de sangre periférica en horas de la mañana (8 a 10 hs) de 10 voluntarios normales (por serología y hemograma) y de 10 pacientes HIV positivos con valores previos de CD4 que variaron entre 200-350 células por microlito y fueron procesadas dentro de las 12 horas. Cada centro obtuvo los valores relativos con el procedimiento técnico habitual y el de los valores absolutos utilizando el hemograma propio. Además, en un contador hematológico Cell-Dyn 3500 se obtuvo para cada muestra el hemograma correspondiente considerado de referencia. Los valores absolutos medios, obtenidos en cada centro con el hemograma propio, para los linfocitos T y los de sus subpoblaciones fueron significativamente diferentes. No hubo diferencias significativas para los valores porcentuales entre los diferentes centros ni para los valores absolutos obtenidos con el hemograma de referencia. Concluimos que las diferencias en los valores absolutos de los linfocitos T y sus subpoblaciones dependen del recuento hematológico empleado.