Alternative Methods as Tools for Obesity Research: In Vitro and In Silico Approaches.

The study of adipogenesis is essential for understanding and treating obesity, a multifactorial problem related to body fat accumulation that leads to several life-threatening diseases, becoming one of the most critical public health problems worldwide. In this review, we propose to provide the highlights of the adipogenesis study based on in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs). We list in silico methods, such as molecular docking for identification of molecular targets, and in vitro approaches, from 2D, more straightforward and applied for screening large libraries of substances, to more representative physiological models, such as 3D and bioprinting models. We also describe the development of physiological models based on microfluidic systems applied to investigate adipogenesis in vitro. We intend to identify the main alternative models for adipogenesis evaluation, contributing to the direction of preclinical research in obesity. Future directions indicate the association of in silico and in vitro techniques to bring a clear picture of alternative methods based on adipogenesis as a tool for obesity research.

Identificação de uma possível histona-linker em Toxoplasma gondii

A estrutura da cromatina é uma barreira que limita o acesso ao DNA pelos complexos proteicos. A alternância do nível de compactação da cromatina é regulada principalmente pelas histonas e suas modificações pós traducionais (MPTs). Toxoplasma gondii (T. gondii) possui as quatro histonas canônicas (H2A, H2B, H3 e H4), mas até o momento a quinta histona, H1 (ou histona-linker) não foi identificada. Em outros eucariotos, a histona H1 é parte fundamental na compactação da cromatina e sua ausência poderia levar a um estado menos compactado da cromatina em T. gondii. Identificamos uma possível histona H1, similar a H1-like de Kinetoplastidae, e que corresponde apenas à porção C-terminal de uma histona H1 típica, a qual denominamos TgH1-like. Através de análise estrutural in silico, verificamos que a proteína apresenta características comuns a histonas como um potencial eletrostático bastante positivo, devido à abundância em lisinas e argininas nessas proteínas. Para predição da função de TgH1-like, utilizamos o servidor ProFunc, onde obtivemos correspondência com modelo de histona h1b, sugerindo que TgH1-like poderia ter função de histona em Toxoplasma. Para caracterizar TgH1-like, realizamos o etiquetamento do epitopo do gene endógeno. Através de ensaio de imunofluorescência, foi possível verificar que a TgH1-like está localizado exclusivamente no núcleo do parasita. No entanto, por ensaios de western blot, TgH1-like-HA migrou como uma proteína de ~20 kDa, ao invés dos 9 kDa esperados para sua massa presvista. As histonas H1, assim como as demais histonas, são alvo de diversas MPTs, como metilação, acetilação, fosforilação e ubiquitinação. Recentemente foram identificados diversos sítios de ubiquitinação em proteínas de Toxoplasma, incluindo TgH1-like, o que corresponderia a um aumento de tamanho compatível com o encontrado. Para verificar se TgH1-like está associada a cromatina de T. gondii, realizamos um protocolo de extração de histonas por fracionamento celular, onde confirmamos a sua localização nuclear, e observamos uma parcela associada ao DNA juntamente com outras histonas, como a H4. Essa interação foi confirmada por ensaio de coimunoprecipitação, mostrando que a histona H4 precipita juntamente com a TgH1-like. Em busca de dados funcionais, realizamos o nocaute de tgh1-like, que não mostrou-se essencial a sobrevivência do parasita. Ensaios preliminares com parasitas DTgH1-like, através de ensaio de placa, resultou em um número de placas de lise maior quando comparado a parasitas controles, indicando que a replicação celular está alterada nesses parasitas. Corroborando esses dados, ensaios de imunofluorescencia indicaram um número maior de parasitas por vacúolo. Juntos, nossos dados indicam que TgH1-like está associada ao DNA e forma um complexo com outras histonas. Além disso, parasitas nocautes apresentaram alteração no ciclo celular do parasita, embora mais evidências sejam necessárias para corroborar tal alteração. Mostramos que TgH1-like apresenta características de histonas, não é essencial ao parasita, e outras análises funcionais estão em andamento para confirmarmos seu papel em T. gondii.